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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
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peace12039088

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-28 18:39:43
这样的问题建议做电转化，效率会高些。此外目标片段与目标载体的比例不一定非要按照理论比例，可以依据回收后的电泳检测结果来加入，这样可能有点不科学，但我每次都是这样做出来的。还有就是电泳显示的同样亮度的大小不同片段，片段大的浓度低，片段小的浓度高。
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21楼2011-06-27 11:09:42
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八头小猪

铁杆木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
感受态效率要高！
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22楼2011-06-27 12:27:08
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cxwu10016869

金虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): Good！ 2011-06-28 18:40:01
1、插入片段：载体=3:1~10:1（摩尔数比）都可以，但插入片段不要太少了。
2、抗生素别出问题
3、注意连接酶的使用温度和方法；不同公司的酶连接时的温度不同，连接体系也会不同。
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23楼2011-06-27 12:53:04
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-06-22 12:01:59:
你那个载体是怎么处理的？双酶切后电泳切胶回收的吗？回收完的载体有没有跑胶验证？还有最好把你的连接体系发上来让大家看看才能找到问题

是做的胶回收，也跑胶验证了，没问题啊，浓度也不错
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
24楼2011-06-28 13:48:31
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by peace12039088 at 2011-06-27 11:09:42:
这样的问题建议做电转化，效率会高些。此外目标片段与目标载体的比例不一定非要按照理论比例，可以依据回收后的电泳检测结果来加入，这样可能有点不科学，但我每次都是这样做出来的。还有就是电泳显示的同样亮度的 ...

谢谢指点
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
25楼2011-06-28 13:49:41
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cxwu10016869 at 2011-06-27 12:53:04:
1、插入片段：载体=3:1~10:1（摩尔数比）都可以，但插入片段不要太少了。
2、抗生素别出问题
3、注意连接酶的使用温度和方法；不同公司的酶连接时的温度不同，连接体系也会不同。

恩，感谢指点
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
26楼2011-06-28 13:49:57
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lihuaannie at 2011-06-22 11:32:46:
建议你把片段和载体的比例 再放大10:1都可以

再试试吧
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
27楼2011-06-28 13:50:45
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幸福常在

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
请问楼主问题解决了么？我的问题是连接转化后，也长斑的，就是PCR检测的时候，用特异性引物检测不到条带，用通用引物发现是空载体。目前已经做了五遍了，还是这个问题，vector：insert=1.5:6.5，连接之后做过电泳检测，发现只有一条的大于2000KB的条带，未发现插入基因条带。
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28楼2012-02-26 23:36:53
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catq

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
可能是酶量不够或不配，不知用的是什么buffer. 你可以用酶切设计软件试试。 www.bioinfomatics.cn/enzyme/
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29楼2012-03-14 20:56:20
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麻花13

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
1，尝试电转 2 注意酶切体系及酶连体系中各DNA的浓度（用酶标仪测，尤其注意OD260/280的值）
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30楼2012-03-15 00:31:09
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