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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点 已有25人参与

我现在在做一个基因的昆虫表达，表达载体是用的是pFast HT A（载体有4850bp）。我的基因目前上到了PMD18-T的载体上，带酶切位点，已经测序验证了，基因和酶切位点及保护碱基都是完整正确的，内切酶用得是Hind III 和Spe I
酶切回收的片段和载体质量都还不错，条带明亮单一，浓度约为50ng/ul
反复做了好多次，T4连接酶过夜连接 做转化，都是不长斑。
隐形对照加的酶切后的空载体，阳性对照用得是未酶切的载体，结果也没问题。
T4连接酶买的新的，感受态也是新的。
那么我的问题到底出在哪里呢？
求高手指点。非常感谢，现在做的都快吐了……
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
1楼 2011-06-22 10:03:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cxwu10016869

金虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): Good！ 2011-06-28 18:40:01
1、插入片段：载体=3:1~10:1（摩尔数比）都可以，但插入片段不要太少了。
2、抗生素别出问题
3、注意连接酶的使用温度和方法；不同公司的酶连接时的温度不同，连接体系也会不同。
赞一下(2人) 回复此楼
23楼2011-06-27 12:53:04
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking: 2011-06-22 18:50:37
怎么看的那么糊涂？还是我智商有问题？
楼主是不是想把PMD载体上的一段双酶切下来然后连接至pFast HT A上进行表达呢？
赞一下(2人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-06-22 10:06:56
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-22 10:06:56:
怎么看的那么糊涂？还是我智商有问题？
楼主是不是想把PMD载体上的一段双酶切下来然后连接至pFast HT A上进行表达呢？

是的呢
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
3楼2011-06-22 10:13:03
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garry86

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-06-22 16:51:41
本帖内容被屏蔽
4楼2011-06-22 10:21:34
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查看全部 53 个回答
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