双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点 - 分子生物 - 综合其他

难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过

11楼2011-06-22 11:07:38

lihuaannie

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西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-22 16:52:48

建议你把片段和载体的比例再放大10:1都可以

12楼2011-06-22 11:32:46

yuxia82012

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西瓜(金币+3): 鼓励热心交流 2011-06-22 16:53:38

你那个载体是怎么处理的？双酶切后电泳切胶回收的吗？回收完的载体有没有跑胶验证？还有最好把你的连接体系发上来让大家看看才能找到问题

在等待中涅槃重生

13楼2011-06-22 12:01:59

ztiger

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西瓜(金币+2): good 2011-06-22 16:54:03

有可能是转化效率的问题，空载体和连接产物的转化效率没有可比性，不知你用的是什么转化方法，电转化效率很高，你可以试试。

14楼2011-06-22 12:36:21

yoyoyoyo3985

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引用回帖:

Originally posted by ztiger at 2011-06-22 12:36:21:
有可能是转化效率的问题，空载体和连接产物的转化效率没有可比性，不知你用的是什么转化方法，电转化效率很高，你可以试试。

没试过电转化

难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过

15楼2011-06-22 12:53:12

lxybio

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换个酶？
换个载体？
或者干脆换换手？

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16楼2011-06-22 13:51:30

yangym1123

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dhd997(金币+2): 鼓励一下 2011-06-23 09:43:39

我觉得事连接的问题，连接目的片段和载体的比例要合适，不是越多越好，并且有时候实验你老是做不好，就让别人给你做下，或者过段时间再做会好点！

17楼2011-06-22 18:40:04

yoyoyoyo3985

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引用回帖:

Originally posted by yangym1123 at 2011-06-22 18:40:04:
我觉得事连接的问题，连接目的片段和载体的比例要合适，不是越多越好，并且有时候实验你老是做不好，就让别人给你做下，或者过段时间再做会好点！

恩恩，着急是真没用%……

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18楼2011-06-22 22:31:14

wlsky24

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将连接体系中片段的浓度提高点。6:1或者7:1.平板的抗生素是涂上去的还是加入后倒平板的？建议加入后倒平板。

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19楼2011-06-27 09:52:47

sfb1020

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连接载体和插入片段的摩尔比1 ：2～10。
胶回收的DNA没有问题吗？
我曾经也有类似的经历，结果是我粗心导致的。

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20楼2011-06-27 10:05:33