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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-22 11:03:29:
个人认为是你连接体系的问题，不知道你的体系是怎么样的？
可以将DNA浓度提高一些，是在载体的2-3倍。也可以连接时间长一些。。。

浓度配比都做了一个梯度了，vector：insert   1:3；1:1；3:1都试过了……
难道是浓度还是偏低的原因？
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
11楼2011-06-22 11:07:38
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lihuaannie

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-22 16:52:48
建议你把片段和载体的比例 再放大10:1都可以
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12楼2011-06-22 11:32:46
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 鼓励热心交流 2011-06-22 16:53:38
你那个载体是怎么处理的？双酶切后电泳切胶回收的吗？回收完的载体有没有跑胶验证？还有最好把你的连接体系发上来让大家看看才能找到问题
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在等待中涅槃重生
13楼2011-06-22 12:01:59
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ztiger

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): good 2011-06-22 16:54:03
有可能是转化效率的问题，空载体和连接产物的转化效率没有可比性，不知你用的是什么转化方法，电转化效率很高，你可以试试。
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14楼2011-06-22 12:36:21
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ztiger at 2011-06-22 12:36:21:
有可能是转化效率的问题，空载体和连接产物的转化效率没有可比性，不知你用的是什么转化方法，电转化效率很高，你可以试试。

没试过电转化
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
15楼2011-06-22 12:53:12
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lxybio

新虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
换个酶？
换个载体？
或者干脆换换手？
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16楼2011-06-22 13:51:30
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yangym1123

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 鼓励一下 2011-06-23 09:43:39
我觉得事连接的问题，连接目的片段和载体的比例要合适，不是越多越好，并且有时候实验你老是做不好，就让别人给你做下，或者过段时间再做会好点！
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17楼2011-06-22 18:40:04
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yangym1123 at 2011-06-22 18:40:04:
我觉得事连接的问题，连接目的片段和载体的比例要合适，不是越多越好，并且有时候实验你老是做不好，就让别人给你做下，或者过段时间再做会好点！

恩恩，着急是真没用%……
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
18楼2011-06-22 22:31:14
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wlsky24

新虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
将连接体系中片段的浓度提高点。6:1或者7:1.平板的抗生素是涂上去的还是加入后倒平板的？建议加入后倒平板。
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19楼2011-06-27 09:52:47
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sfb1020

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
连接载体和插入片段的摩尔比1 ：2～10。
胶回收的DNA没有问题吗？
我曾经也有类似的经历，结果是我粗心导致的。
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20楼2011-06-27 10:05:33
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