应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
535/6返回列表上一页123456下一页
查看: 4634  |  回复: 52
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
40楼: Originally posted by doughtiness at 2013-06-05 15:58:19
您好！我现在遇到了跟您一样的问题，您后来怎么解决的呢？

主要还是酶切回收产物的控制，要保持比较高的浓度才比较容易连接成功。如果真的难以解决，建议你用infusion酶做克隆吧，这个只要切一下质粒，反应体系也比较容易控制，效率很高，就是比较贵
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

doughtiness
难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
41楼2013-06-07 09:34:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
引用回帖:
41楼: Originally posted by yoyoyoyo3985 at 2013-06-07 09:34:49
主要还是酶切回收产物的控制，要保持比较高的浓度才比较容易连接成功。如果真的难以解决，建议你用infusion酶做克隆吧，这个只要切一下质粒，反应体系也比较容易控制，效率很高，就是比较贵...

灰常感谢您的回复，您后来做成功用得是哪种酶呢？需要比较高的浓度，那这个“高浓度”您认为是多少呢？求您的指点噢，先谢过啦
另外，顺便问下infusion酶贵到什么程度呢？
赞一下 回复此楼
42楼2013-06-07 10:03:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
42楼: Originally posted by doughtiness at 2013-06-07 10:03:44
灰常感谢您的回复，您后来做成功用得是哪种酶呢？需要比较高的浓度，那这个“高浓度”您认为是多少呢？求您的指点噢，先谢过啦
另外，顺便问下infusion酶贵到什么程度呢？...

你上网查一下吧，clontech的，我记得是十个反应一千几百块吧，不过可以拆成20个反应来用。我最后就是用infusion做的，虽然后来T4连接酶也连上了，高是相对而言，最低也要超不多几十个ng/ul
赞一下 回复此楼
难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
43楼2013-06-17 08:24:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
第一，酶切时间稍微长点，条带要细，楼主好像说酶切过的质粒转化了感受态没长，那证明酶切效果没问题
二：感受态要好用，楼主验证过没，如果可以用那应该也没问题
三：连接，楼主连用的那个公司的，最好4℃过夜，然后白天在16℃连几个小时转化，或16℃连接过夜（注意16摄氏度连过夜绝对能连上，我这么连每次都长30-40个），如果楼主16℃连过夜还不怎么长，那很大问题，我觉得在回收上面

不是回收浓度的问题，可能就是纯度不太好，质量不太好
赞一下 回复此楼
44楼2013-06-18 13:12:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)
根本不需要那么夸张，我们就用的NEB的T4连接酶，一周俺就做了几个克隆，挑质粒到手软啊。。
赞一下 回复此楼
45楼2013-06-18 13:14:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
片段比载体小的比较多的话，推荐1：10，比例你按它们大小来估算小1：3-1：10都可以
赞一下 回复此楼
46楼2013-06-18 13:16:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
46楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-06-18 13:16:34
片段比载体小的比较多的话，推荐1：10，比例你按它们大小来估算小1：3-1：10都可以

我的目的基因是1100bp，质粒是3700bp，我根据核酸电泳大致地估算它的浓度，然后根据目的基因：质粒的摩尔比=2:1配的连接体系，可是转到感受态里就是不长，那我用1:5试试吧
赞一下 回复此楼
47楼2013-06-19 13:03:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
45楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-06-18 13:14:06
根本不需要那么夸张，我们就用的NEB的T4连接酶，一周俺就做了几个克隆，挑质粒到手软啊。。

真羡慕你，要是我能连接上就好了
赞一下 回复此楼
48楼2013-06-19 13:03:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
43楼: Originally posted by yoyoyoyo3985 at 2013-06-17 08:24:39
你上网查一下吧，clontech的，我记得是十个反应一千几百块吧，不过可以拆成20个反应来用。我最后就是用infusion做的，虽然后来T4连接酶也连上了，高是相对而言，最低也要超不多几十个ng/ul...

恩，好吧，我再用T4连接酶试试看
赞一下 回复此楼
49楼2013-06-19 13:04:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
44楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-06-18 13:12:18
第一，酶切时间稍微长点，条带要细，楼主好像说酶切过的质粒转化了感受态没长，那证明酶切效果没问题
二：感受态要好用，楼主验证过没，如果可以用那应该也没问题
三：连接，楼主连用的那个公司的，最好4℃过夜， ...

连接酶是Promega公司，连接时间太长是不是不好啊，我上次都在16℃下连接了24个小时，结果还是不佳啊，我快无语了
赞一下 回复此楼
50楼2013-06-19 13:06:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yoyoyoyo3985 的主题更新
535/6返回列表上一页123456下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 341求调剂 +7 青柠檬1 2026-03-26 7/350 2026-03-27 00:19 by wxiongid
[考研] 329求调剂 +6 钮恩雪 2026-03-25 6/300 2026-03-26 22:50 by fmesaito
[考研] 一志愿华理，数一英一285求A区调剂 +8 AZMK 2026-03-25 10/500 2026-03-26 22:37 by 学员8dgXkO
[考研] 327求调剂 +7 prayer13 2026-03-23 7/350 2026-03-26 20:48 by 不吃魚的貓
[考研] 调剂 +4 柚柚yoyo 2026-03-26 4/200 2026-03-26 20:43 by fmesaito
[考研] 291求调剂 +9 hhhhxn.. 2026-03-23 9/450 2026-03-26 18:59 by 不吃魚的貓
[考研] 340求调剂 +3 Amber00 2026-03-26 3/150 2026-03-26 18:57 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿211 初试270分 求调剂 +6 谷雨上岸 2026-03-23 7/350 2026-03-26 18:55 by 不吃魚的貓
[考研] 085602 289分求调剂 +8 WWW西西弗斯 2026-03-24 8/400 2026-03-26 16:33 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿陕师大生物学071000，298分，求调剂 +4 SYA！ 2026-03-23 4/200 2026-03-26 15:27 by caiaijun80
[考研] 总分293求调剂 +6 加一一九 2026-03-25 8/400 2026-03-26 13:30 by yujianx
[考研] 一志愿中南大学化学学硕0703总分337求调剂 +7 niko- 2026-03-22 7/350 2026-03-25 20:14 by qingfeng258
[考研] 26考研-291分-厦门大学（085601）-柔性电子学院材料工程专业求调剂 +3 min3 2026-03-24 4/200 2026-03-25 18:22 by xcjcqu
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-24 3/150 2026-03-24 21:31 by peike
[考研] 306求0703调剂一志愿华中师范 +10 纸鱼ly 2026-03-21 11/550 2026-03-24 17:22 by qingfeng258
[考研] 300求调剂，材料科学英一数二 +5 leaflight 2026-03-24 5/250 2026-03-24 16:25 by laoshidan
[考研] 277分求调剂，跨调材料 +3 考研调剂lxh 2026-03-24 3/150 2026-03-24 13:52 by JourneyLucky
[考研] 275求调剂 +6 shansx 2026-03-22 8/400 2026-03-22 15:27 by barlinike
[考研] 一志愿华中科技大学071000，求调剂 +4 沿岸有贝壳6 2026-03-21 4/200 2026-03-22 07:21 by ilovexiaobin
[考研] 考研调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-21 3/150 2026-03-21 20:04 by 无际的草原
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭