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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
40楼: Originally posted by doughtiness at 2013-06-05 15:58:19
您好！我现在遇到了跟您一样的问题，您后来怎么解决的呢？

主要还是酶切回收产物的控制，要保持比较高的浓度才比较容易连接成功。如果真的难以解决，建议你用infusion酶做克隆吧，这个只要切一下质粒，反应体系也比较容易控制，效率很高，就是比较贵
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doughtiness
难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
41楼2013-06-07 09:34:49
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doughtiness

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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41楼: Originally posted by yoyoyoyo3985 at 2013-06-07 09:34:49
主要还是酶切回收产物的控制，要保持比较高的浓度才比较容易连接成功。如果真的难以解决，建议你用infusion酶做克隆吧，这个只要切一下质粒，反应体系也比较容易控制，效率很高，就是比较贵...

灰常感谢您的回复，您后来做成功用得是哪种酶呢？需要比较高的浓度，那这个“高浓度”您认为是多少呢？求您的指点噢，先谢过啦
另外，顺便问下infusion酶贵到什么程度呢？
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42楼2013-06-07 10:03:44
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
42楼: Originally posted by doughtiness at 2013-06-07 10:03:44
灰常感谢您的回复，您后来做成功用得是哪种酶呢？需要比较高的浓度，那这个“高浓度”您认为是多少呢？求您的指点噢，先谢过啦
另外，顺便问下infusion酶贵到什么程度呢？...

你上网查一下吧，clontech的，我记得是十个反应一千几百块吧，不过可以拆成20个反应来用。我最后就是用infusion做的，虽然后来T4连接酶也连上了，高是相对而言，最低也要超不多几十个ng/ul
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
43楼2013-06-17 08:24:39
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ivyvampire

新虫 (正式写手)
★
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第一，酶切时间稍微长点，条带要细，楼主好像说酶切过的质粒转化了感受态没长，那证明酶切效果没问题
二：感受态要好用，楼主验证过没，如果可以用那应该也没问题
三：连接，楼主连用的那个公司的，最好4℃过夜，然后白天在16℃连几个小时转化，或16℃连接过夜（注意16摄氏度连过夜绝对能连上，我这么连每次都长30-40个），如果楼主16℃连过夜还不怎么长，那很大问题，我觉得在回收上面

不是回收浓度的问题，可能就是纯度不太好，质量不太好
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44楼2013-06-18 13:12:18
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ivyvampire

新虫 (正式写手)
根本不需要那么夸张，我们就用的NEB的T4连接酶，一周俺就做了几个克隆，挑质粒到手软啊。。
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45楼2013-06-18 13:14:06
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ivyvampire

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
片段比载体小的比较多的话，推荐1：10，比例你按它们大小来估算小1：3-1：10都可以
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46楼2013-06-18 13:16:34
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doughtiness

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
46楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-06-18 13:16:34
片段比载体小的比较多的话，推荐1：10，比例你按它们大小来估算小1：3-1：10都可以

我的目的基因是1100bp，质粒是3700bp，我根据核酸电泳大致地估算它的浓度，然后根据目的基因：质粒的摩尔比=2:1配的连接体系，可是转到感受态里就是不长，那我用1:5试试吧
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47楼2013-06-19 13:03:08
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doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
45楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-06-18 13:14:06
根本不需要那么夸张，我们就用的NEB的T4连接酶，一周俺就做了几个克隆，挑质粒到手软啊。。

真羡慕你，要是我能连接上就好了
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48楼2013-06-19 13:03:57
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doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
43楼: Originally posted by yoyoyoyo3985 at 2013-06-17 08:24:39
你上网查一下吧，clontech的，我记得是十个反应一千几百块吧，不过可以拆成20个反应来用。我最后就是用infusion做的，虽然后来T4连接酶也连上了，高是相对而言，最低也要超不多几十个ng/ul...

恩，好吧，我再用T4连接酶试试看
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49楼2013-06-19 13:04:40
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doughtiness

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
44楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-06-18 13:12:18
第一，酶切时间稍微长点，条带要细，楼主好像说酶切过的质粒转化了感受态没长，那证明酶切效果没问题
二：感受态要好用，楼主验证过没，如果可以用那应该也没问题
三：连接，楼主连用的那个公司的，最好4℃过夜， ...

连接酶是Promega公司，连接时间太长是不是不好啊，我上次都在16℃下连接了24个小时，结果还是不佳啊，我快无语了
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50楼2013-06-19 13:06:30
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