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yoyoyoyo3985金虫 (小有名气)
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[交流]
双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点 已有25人参与
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我现在在做一个基因的昆虫表达，表达载体是用的是pFast HT A（载体有4850bp）。我的基因目前上到了PMD18-T的载体上，带酶切位点，已经测序验证了，基因和酶切位点及保护碱基都是完整正确的，内切酶用得是Hind III 和Spe I 酶切回收的片段和载体质量都还不错，条带明亮单一，浓度约为50ng/ul 反复做了好多次，T4连接酶过夜连接 做转化，都是不长斑。 隐形对照加的酶切后的空载体，阳性对照用得是未酶切的载体，结果也没问题。 T4连接酶买的新的，感受态也是新的。 那么我的问题到底出在哪里呢？ 求高手指点。非常感谢，现在做的都快吐了…… |
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yoyoyoyo3985
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主要还是酶切回收产物的控制，要保持比较高的浓度才比较容易连接成功。如果真的难以解决，建议你用infusion酶做克隆吧，这个只要切一下质粒，反应体系也比较容易控制，效率很高，就是比较贵 |
doughtiness41楼2013-06-07 09:34:49
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2楼2011-06-22 10:06:56
yoyoyoyo3985
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3楼2011-06-22 10:13:03
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4楼2011-06-22 10:21:34
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