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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体双酶切
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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生

[求助] 表达载体双酶切

本人从T载体上切下目的片段，连到表达载体pQE30上用的是ECORI和SPHI但是酶切就是很难切下来
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寻找方向，前进
1楼 2011-12-20 09:45:06
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+2): Good! 2011-12-20 15:08:34
junxiao0320(金币+5): ★★★很有帮助 谢谢您，我试一下， 2011-12-20 19:46:33
junxiao0320: 金币+4 2012-03-16 22:03:32
SPHI是不是酶切效率不高，能不能加大酶量过夜酶切？再有NEB他们现在有许多HF的酶，楼主可以查一下看有没有SPHI。
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jiayoubashaonian
2楼2011-12-20 11:58:18
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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junxiao0320: 金币+2 2012-03-16 22:03:26
楼上说的对，这种情况只能换好一点酶试试了，要不就只能换酶切位点
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在等待中涅槃重生
3楼2011-12-20 14:31:15
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+3): 值得注意 2011-12-20 23:55:09
junxiao0320: 金币+4 2012-03-16 22:03:46
你用的是哪个公司的酶，双酶切时要注意下列多种因素：
Buffer是否兼容；酶量是否足够（不同公司在定义酶的活性单位时用的底物并不完全相同，因而即使相同名字的酶，如来自不同的公司，使用量也不尽相同，根据酶单位定义的底物可以进行大致的估算）；控制酶切体系的甘油浓度（小于10%）；当然质粒的质量也很重要。
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4楼2011-12-20 21:33:30
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 支持 2011-12-20 23:55:26
junxiao0320: 金币+2 2012-03-16 22:03:56
junxiao0320: 金币+3 2012-03-18 14:53:56
双酶切找个兼容的Buffer很重要，如果找不到能提供两个酶50%活力的buffer，一个办法是增加酶量和酶切时间，但可能出现星号活力，还有一个办法就是分两次单酶切，各选择最高活性的buffer，这个办法可行，就是麻烦点。
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5楼2011-12-20 22:41:59
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catq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-12-20 22:41:59:
双酶切找个兼容的Buffer很重要，如果找不到能提供两个酶50%活力的buffer，一个办法是增加酶量和酶切时间，但可能出现星号活力，还有一个办法就是分两次单酶切，各选择最高活性的buffer，这个办法可行，就是麻烦点。

NEB中我用下列的Buffer,用Double Digestion Designer设计的。
一开始我查资料看两个酶活性，结果发现1，2，4都貌似很好，系统为啥推荐我用buffer EcoRI,后来咨询后才知道，原来是NEB测试最佳结果推荐。。。
差点走了冤枉路。

DDD设计的



酶活表
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6楼2012-03-14 20:24:05
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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-20 11:58:18:
SPHI是不是酶切效率不高，能不能加大酶量过夜酶切？再有NEB他们现在有许多HF的酶，楼主可以查一下看有没有SPHI。

我也用啦NEB的啦，建议5分钟，但效率不高啊
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寻找方向，前进
7楼2012-03-15 10:50:29
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by junxiao0320 at 2012-03-15 10:50:29:
我也用啦NEB的啦，建议5分钟，但效率不高啊

延长时间到3-4小时切可以吗？
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jiayoubashaonian
8楼2012-03-15 13:38:46
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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Fermentas 的快速内切酶5分钟就可切开了，而且这些快速内切酶都有一个通用的快速内切buffer:Fast Digest buffer。
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9楼2012-03-15 17:46:11
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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可以分两次单酶切进行，另外你的质粒的质量很重要，纯度要高，跑胶的时候带要亮，你酶切的体系可以扩大一下，时间延长
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关关雎鸠，在河之洲
10楼2012-03-15 17:50:07
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