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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生

[求助] 表达载体双酶切

本人从T载体上切下目的片段,连到表达载体pQE30上用的是ECORI和SPHI但是酶切就是很难切下来
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
1949stone(金币+3): 值得注意 2011-12-20 23:55:09
junxiao0320: 金币+4 2012-03-16 22:03:46
你用的是哪个公司的酶,双酶切时要注意下列多种因素:
Buffer是否兼容;酶量是否足够(不同公司在定义酶的活性单位时用的底物并不完全相同,因而即使相同名字的酶,如来自不同的公司,使用量也不尽相同,根据酶单位定义的底物可以进行大致的估算);控制酶切体系的甘油浓度(小于10%);当然质粒的质量也很重要。
4楼2011-12-20 21:33:30
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+2): Good! 2011-12-20 15:08:34
junxiao0320(金币+5): ★★★很有帮助 谢谢您,我试一下, 2011-12-20 19:46:33
junxiao0320: 金币+4 2012-03-16 22:03:32
SPHI是不是酶切效率不高,能不能加大酶量过夜酶切?再有NEB他们现在有许多HF的酶,楼主可以查一下看有没有SPHI。
jiayoubashaonian
2楼2011-12-20 11:58:18
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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junxiao0320: 金币+2 2012-03-16 22:03:26
楼上说的对,这种情况只能换好一点酶试试了,要不就只能换酶切位点
在等待中涅槃重生
3楼2011-12-20 14:31:15
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 支持 2011-12-20 23:55:26
junxiao0320: 金币+2 2012-03-16 22:03:56
junxiao0320: 金币+3 2012-03-18 14:53:56
双酶切找个兼容的Buffer很重要,如果找不到能提供两个酶50%活力的buffer,一个办法是增加酶量和酶切时间,但可能出现星号活力,还有一个办法就是分两次单酶切,各选择最高活性的buffer,这个办法可行,就是麻烦点。
5楼2011-12-20 22:41:59
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