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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » DNA双酶切后在两端加adapter的连接问题
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jyongchao

木虫 (正式写手)

[求助] DNA双酶切后在两端加adapter的连接问题

各位高手，最近在做MSAP，要求先将总DNA经EcoR I 和Msp I（或Hpa II）酶切，然后在所有DNA片段两端要加上接头，PCR后跑胶看条带，对其中的连接一步不太懂，想请教几个问题：
     1、我的adapters有四个：EcoRI-adapterI、EcoRI-adapter II、H/M-adapterI、H/M-adapter II 都是合成的单链，如果进行连接是不是先要分别将EcoRI-adapterI和EcoRI-adapter II、H/M-adapterI和H/M-adapter II 配对后才能连？怎么配对呢？ 直接56℃退火？
     2、我的T4连接酶是TaKaRa的，说明书上的例子是载体连接，这个连接体系能不能用到我这个上呢？因为包装是350U/ul ，说明书上是加了1ul 过夜16℃反应，感觉酶有点多呀
   3、EcoRI-adapter和H/M-adapter的比例、adapter与总DNA量的比例调成多少才能有比较好的连接效率？
   4、连接完成后直接PCR对最后的PCR效果有没有影响？

[ Last edited by jyongchao on 2011-10-16 at 20:57 ]
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1楼2011-10-16 20:46:57
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xiaobao261

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
看天(金币+2): 鼓励一下 2011-11-14 21:36:20
jyongchao(金币+2): 谢谢 2011-11-26 00:13:16
接头需要1和2混合变性后复性，才能用。100摄氏度变性5分钟，缓慢冷却至室温。
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2楼2011-11-14 10:27:20
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水中小妖

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
看天(金币+3): 鼓励交流 2011-11-14 21:36:36
我用的接头是这样退火的：
EcoR1：EcoR1-F（10uM）0.5ul
            EcoR1-R（10uM）0.5ul
            去离子水          1ul

Hpa/Mse： F （12.5uM） 4ul
                R （12.5uM） 4ul
                去离子水2ul

95° 5min，室温冷却后-20°保存。
酶切时H/M接头10ul，E接头2ul，总体积25ul。
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路漫漫其修远，吾将上下而求索~
3楼2011-11-14 21:21:48
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jyongchao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 水中小妖 at 2011-11-14 21:21:48:
我用的接头是这样退火的：
EcoR1：EcoR1-F（10uM）0.5ul
            EcoR1-R（10uM）0.5ul
            去离子水          1ul

Hpa/Mse： F （12.5uM） 4ul
                R （12.5uM） 4ul
          ...

额，谢谢，不过你不应助我给不了金币呀
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4楼2011-11-26 00:15:43
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wangcongxs

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
telomerase: 金币+2, 欢迎多多交流！ 2012-03-24 21:11:20
jyongchao: 金币+2, 谢谢 2012-03-30 23:05:08
引用回帖:
4145059楼: Originally posted by jyongchao at 2011-11-26 00:15:43:
额，谢谢，不过你不应助我给不了金币呀

上面那个好用吗？我是ECOR1正反接头稀释到15uM分别取10ul在加10ul加水终浓度5uM,hm的接头稀释到100uM，分别取15ul混合至50uM，单链变双链PCR程序65度10分钟，37度10分钟，25度10分钟，4度保存。
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做最好的自己
5楼2012-03-24 20:11:18
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jyongchao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4490505楼: Originally posted by wangcongxs at 2012-03-24 20:11:18:
上面那个好用吗？我是ECOR1正反接头稀释到15uM分别取10ul在加10ul加水终浓度5uM,hm的接头稀释到100uM，分别取15ul混合至50uM，单链变双链PCR程序65度10分钟，37度10分钟，25度10分钟，4度保存。

我现在用的跟你说的差不多，不过单链变双链是95度5min后室温冷却。
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6楼2012-03-30 23:12:38
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rr6666ugh

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2012-08-24 15:44:49
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王玉哈哈哈

新虫 (正式写手)
想请教你双酶切的步骤，我也是做MSAP 但是酶切一直是上方有弥散，下方没有弥散  DNA浓度大约600ng/ul  酶切时间12小时，不知道啥原因？
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8楼2018-03-27 09:21:11
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