应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » DNA双酶切后在两端加adapter的连接问题
81/1返回列表
查看: 3306  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

jyongchao

木虫 (正式写手)

[求助] DNA双酶切后在两端加adapter的连接问题

各位高手，最近在做MSAP，要求先将总DNA经EcoR I 和Msp I（或Hpa II）酶切，然后在所有DNA片段两端要加上接头，PCR后跑胶看条带，对其中的连接一步不太懂，想请教几个问题：
     1、我的adapters有四个：EcoRI-adapterI、EcoRI-adapter II、H/M-adapterI、H/M-adapter II 都是合成的单链，如果进行连接是不是先要分别将EcoRI-adapterI和EcoRI-adapter II、H/M-adapterI和H/M-adapter II 配对后才能连？怎么配对呢？ 直接56℃退火？
     2、我的T4连接酶是TaKaRa的，说明书上的例子是载体连接，这个连接体系能不能用到我这个上呢？因为包装是350U/ul ，说明书上是加了1ul 过夜16℃反应，感觉酶有点多呀
   3、EcoRI-adapter和H/M-adapter的比例、adapter与总DNA量的比例调成多少才能有比较好的连接效率？
   4、连接完成后直接PCR对最后的PCR效果有没有影响？

[ Last edited by jyongchao on 2011-10-16 at 20:57 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-10-16 20:46:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaobao261

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
看天(金币+2): 鼓励一下 2011-11-14 21:36:20
jyongchao(金币+2): 谢谢 2011-11-26 00:13:16
接头需要1和2混合变性后复性，才能用。100摄氏度变性5分钟，缓慢冷却至室温。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-11-14 10:27:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

水中小妖

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
看天(金币+3): 鼓励交流 2011-11-14 21:36:36
我用的接头是这样退火的：
EcoR1：EcoR1-F（10uM）0.5ul
            EcoR1-R（10uM）0.5ul
            去离子水          1ul

Hpa/Mse： F （12.5uM） 4ul
                R （12.5uM） 4ul
                去离子水2ul

95° 5min，室温冷却后-20°保存。
酶切时H/M接头10ul，E接头2ul，总体积25ul。
赞一下(2人) 回复此楼
路漫漫其修远，吾将上下而求索~
3楼2011-11-14 21:21:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jyongchao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 水中小妖 at 2011-11-14 21:21:48:
我用的接头是这样退火的：
EcoR1：EcoR1-F（10uM）0.5ul
            EcoR1-R（10uM）0.5ul
            去离子水          1ul

Hpa/Mse： F （12.5uM） 4ul
                R （12.5uM） 4ul
          ...

额，谢谢，不过你不应助我给不了金币呀
赞一下 回复此楼
4楼2011-11-26 00:15:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangcongxs

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
telomerase: 金币+2, 欢迎多多交流！ 2012-03-24 21:11:20
jyongchao: 金币+2, 谢谢 2012-03-30 23:05:08
引用回帖:
4145059楼: Originally posted by jyongchao at 2011-11-26 00:15:43:
额，谢谢，不过你不应助我给不了金币呀

上面那个好用吗？我是ECOR1正反接头稀释到15uM分别取10ul在加10ul加水终浓度5uM,hm的接头稀释到100uM，分别取15ul混合至50uM，单链变双链PCR程序65度10分钟，37度10分钟，25度10分钟，4度保存。
赞一下 回复此楼
做最好的自己
5楼2012-03-24 20:11:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jyongchao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4490505楼: Originally posted by wangcongxs at 2012-03-24 20:11:18:
上面那个好用吗？我是ECOR1正反接头稀释到15uM分别取10ul在加10ul加水终浓度5uM,hm的接头稀释到100uM，分别取15ul混合至50uM，单链变双链PCR程序65度10分钟，37度10分钟，25度10分钟，4度保存。

我现在用的跟你说的差不多，不过单链变双链是95度5min后室温冷却。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2012-03-30 23:12:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rr6666ugh

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2012-08-24 15:44:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王玉哈哈哈

新虫 (正式写手)
想请教你双酶切的步骤，我也是做MSAP 但是酶切一直是上方有弥散，下方没有弥散  DNA浓度大约600ng/ul  酶切时间12小时，不知道啥原因？
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2018-03-27 09:21:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jyongchao 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +6 图啦图啦 2026-08-24 6/300 2026-08-24 17:44 by 小小红帆
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +5 scalable 2026-08-24 5/250 2026-08-24 17:03 by spiderzhuzhi
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +19 koalala 2026-08-24 21/1050 2026-08-24 16:48 by Wei_ren
[基金申请] 估计是周四 +4 archvillain 2026-08-18 4/200 2026-08-24 13:53 by zzuzxg
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +6 炎黄贵胄 2026-08-22 7/350 2026-08-24 11:58 by 6543yes
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 17/850 2026-08-24 10:20 by echo8914667
[基金申请] 科研孤儿太难了 +18 我4大白菜 2026-08-20 19/950 2026-08-24 09:47 by 凯恩广盛催化分�
[基金申请] 明天应该可查了！？ +4 chengyan1220 2026-08-23 4/200 2026-08-24 08:47 by gloomy6159
[基金申请] 什么时候开奖？ +10 CrisMessi 2026-08-18 11/550 2026-08-24 06:50 by 开心的小狮子
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭