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jyongchao木虫 (正式写手)
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DNA双酶切后在两端加adapter的连接问题
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各位高手，最近在做MSAP，要求先将总DNA经EcoR I 和Msp I（或Hpa II）酶切，然后在所有DNA片段两端要加上接头，PCR后跑胶看条带，对其中的连接一步不太懂，想请教几个问题： 1、我的adapters有四个：EcoRI-adapterI、EcoRI-adapter II、H/M-adapterI、H/M-adapter II 都是合成的单链，如果进行连接是不是先要分别将EcoRI-adapterI和EcoRI-adapter II、H/M-adapterI和H/M-adapter II 配对后才能连？怎么配对呢？ 直接56℃退火？ 2、我的T4连接酶是TaKaRa的，说明书上的例子是载体连接，这个连接体系能不能用到我这个上呢？因为包装是350U/ul ，说明书上是加了1ul 过夜16℃反应，感觉酶有点多呀 3、EcoRI-adapter和H/M-adapter的比例、adapter与总DNA量的比例调成多少才能有比较好的连接效率？ 4、连接完成后直接PCR对最后的PCR效果有没有影响？ [ Last edited by jyongchao on 2011-10-16 at 20:57 ] |
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