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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为什么pUC18和DNA片段经过Eco1和Hind3酶切后无法连接
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凌雪

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】为什么pUC18和DNA片段经过Eco1和Hind3酶切后无法连接 已有2人参与

为什么pUC18和DNA片段进过Eco1和Hind3酶切后无法连接，大家帮我分析一下。谢谢
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1楼 2010-10-09 14:22:47
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tianyinghu

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):这要看是哪个公司的酶 2010-10-09 18:09:48
EcoRI是有星号活性的，高甘油浓度，Mn2+,低离子强度下，识别序列会改变，估计是你的体系太小了，也就是相应的酶的量加多了，建议放大体系切，buffer多加点
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2楼2010-10-09 15:24:02
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tianyinghu

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
前提是你其他的东西都是没问题的，片度，酶等等
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3楼2010-10-09 15:26:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
silicare(金币+1):这个可以试 2010-10-09 18:10:07
出问题的时候，一般要重复一次。再重复的时候一定要加对照，你这儿应该设三个对照：
a, EcoRI 单酶切，然后连接转化；
b, HindIII 单酶切，然后连接转化；
c, 尽可能做一个阳性对照；

而且每个单酶切完了都要跑电泳看一看，是不是单酶切都切开了。因为双酶切跟单酶切的条带电泳的时候基本上分辨不出来。所以，要是你的质粒其中一个酶切位点发生突变，你是肯定连不上的。

祝好运。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2010-10-09 16:33:40
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