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凌雪

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】为什么pUC18和DNA片段经过Eco1和Hind3酶切后无法连接 已有2人参与

为什么pUC18和DNA片段进过Eco1和Hind3酶切后无法连接,大家帮我分析一下。谢谢
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tianyinghu

金虫 (小有名气)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
silicare(金币+1):这要看是哪个公司的酶 2010-10-09 18:09:48
EcoRI是有星号活性的,高甘油浓度,Mn2+,低离子强度下,识别序列会改变,估计是你的体系太小了,也就是相应的酶的量加多了,建议放大体系切,buffer多加点
2楼2010-10-09 15:24:02
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tianyinghu

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
前提是你其他的东西都是没问题的,片度,酶等等
3楼2010-10-09 15:26:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献


silicare(金币+1):这个可以试 2010-10-09 18:10:07
出问题的时候,一般要重复一次。再重复的时候一定要加对照,你这儿应该设三个对照:
a, EcoRI 单酶切,然后连接转化;
b, HindIII 单酶切,然后连接转化;
c, 尽可能做一个阳性对照;

而且每个单酶切完了都要跑电泳看一看,是不是单酶切都切开了。因为双酶切跟单酶切的条带电泳的时候基本上分辨不出来。所以,要是你的质粒其中一个酶切位点发生突变,你是肯定连不上的。

祝好运。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2010-10-09 16:33:40
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