24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 625
散金: 60
红花: 1
帖子: 154
在线: 64.2小时
虫号: 600281
注册: 2008-09-12
性别: GG
专业: 生物化学

[交流] 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点已有25人参与

我现在在做一个基因的昆虫表达，表达载体是用的是pFast HT A（载体有4850bp）。我的基因目前上到了PMD18-T的载体上，带酶切位点，已经测序验证了，基因和酶切位点及保护碱基都是完整正确的，内切酶用得是Hind III 和Spe I
酶切回收的片段和载体质量都还不错，条带明亮单一，浓度约为50ng/ul
反复做了好多次，T4连接酶过夜连接做转化，都是不长斑。
隐形对照加的酶切后的空载体，阳性对照用得是未酶切的载体，结果也没问题。
T4连接酶买的新的，感受态也是新的。
那么我的问题到底出在哪里呢？
求高手指点。非常感谢，现在做的都快吐了……

回复此楼

» 猜你喜欢

为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种? 已经有5人回复
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》已经有3人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有252人回复
求助食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社电子版已经有5人回复
胶体几丁质的结晶度？已经有0人回复
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士已经有2人回复
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线已经有5人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过

1楼2011-06-22 10:03:09

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 625
散金: 60
红花: 1
帖子: 154
在线: 64.2小时
虫号: 600281
注册: 2008-09-12
性别: GG
专业: 生物化学

引用回帖:

Originally posted by garry86 at 2011-06-22 10:21:34:
pFast HT A表达载体没使用过~ 至少保证载体上有Hind III 和Spe I两个位点吧，酶切之后要确保载体和片段都被切开了，切胶回收的是正确的片段，然后检查连接体系正确与否~ 连接片段最少需要0.3pmol 载体需要0.0 ...

祝好运啊，我一直没做出来，烦呢