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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酶切位点重合了的两个酶的酶切问题
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恒星年

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】酶切位点重合了的两个酶的酶切问题 已有2人参与

各位高手，我现在要做一个基因的克隆，上游引物只能用NcoI，下游只能用BamHI，但是在载体上这两个酶的酶切位点是重合的，切了一个另外一个就不能切了，应该怎么办啊？
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1楼 2010-11-05 17:59:42
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恒星年

银虫 (正式写手)
怎么没人进来啊？自己顶个先
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2楼2010-11-05 18:35:08
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
恒星年(金币+1):谢谢，但是应该是有办法解决的 2010-11-05 19:03:38
估计得重新构建载体了
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3楼2010-11-05 18:51:15
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
估计得重新构建载体了
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4楼2010-11-05 18:51:27
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
恒星年(金币+1):谢谢，由于特殊要求所以不能单切啊 2010-11-09 10:28:20
单酶切连接了。
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Thank-you，so-blue.
5楼2010-11-08 12:16:51
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
恒星年(金币+2):谢谢，我去学习下这个方法怎么用，呵呵 2010-11-09 10:29:36
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-11-08 12:16:51:
单酶切连接了。

他设计的双酶切连接，你觉得单酶切连接的方案能行吗？
楼主有没有做过重组，就是设两条带重组臂的上下游引物，重新扩片段，载体经单酶切后把片段用重组酶重组到目标载体那
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
6楼2010-11-08 13:15:22
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shuxian1

银虫 (小有名气)
估计得重新设计引物了
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我与你一起闯天下
7楼2010-11-08 14:09:31
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-11-08 23:06:22
恒星年(金币+1):谢谢 2010-11-09 10:31:03
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2010-11-08 13:15:22:

他设计的双酶切连接，你觉得单酶切连接的方案能行吗？
楼主有没有做过重组，就是设两条带重组臂的上下游引物，重新扩片段，载体经单酶切后把片段用重组酶重组到目标载体那

单酶切连接还是比较成熟和传统得方法的，载体用碱性磷酸酶处理下，以减少自连。
你所说的用同源重组的方法，不知道是不是SLIC，其实很多这种方法文献来源影响因子倒是挺高的，但是可行性和成功率没有他们吹嘘的那样好。个人感觉还是传统得方法保险。
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Thank-you，so-blue.
8楼2010-11-08 15:44:38
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-11-08 23:06:39
恒星年(金币+1):谢谢，这样的话NcoI就是平末端了 2010-11-09 10:30:14
是否可以先切NcoI，用酶补平之后再加几个碱基在前面，再切BamhI，不知道这样是否可行，非要切这样可以试试，能不能做出来就不知道了
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9楼2010-11-08 16:00:52
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):眼睛要保护 2010-11-10 10:37:34
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-11-08 16:00:52:
是否可以先切NcoI，用酶补平之后再加几个碱基在前面，再切BamHI，不知道这样是否可行，非要切这样可以试试，能不能做出来就不知道了

此方法不可行，NcoI单酶切完了之后进行补平，把刚产生的NcoI的粘性末端也补平了，之后用BamHI确实有可能切开，但得不到NotI的粘性末端

[ Last edited by 空谷幽风 on 2010-11-8 at 17:13 ]
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
10楼2010-11-08 17:05:42
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