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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酶切位点重合了的两个酶的酶切问题
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-08 23:05:37
恒星年(金币+2):谢谢，呵呵，受教了 2010-11-09 10:27:12
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-11-08 15:44:38:

单酶切连接还是比较成熟和传统得方法的，载体用碱性磷酸酶处理下，以减少自连。
你所说的用同源重组的方法，不知道是不是SLIC，其实很多这种方法文献来源影响因子倒是挺高的，但是可行性和成功率没有他们吹嘘的 ...

如果你的片段是通过PCR方法拿到的，并且在载体的酶切位点多引入碱基对你结果没什么影响的话可以试一下这种方法：把载体用NcoI或BamHI单切，然后补平，在进行一步去磷酸化，减少载体自连。载体这样处理后就可以把片段直接装进去了。

另外，同源重组的方法成功率很高的，我们公司每天都在做重组，如果载体片段处理的都没什么问题，只要长得斑基本都是阳性克隆。

[ Last edited by 空谷幽风 on 2010-11-8 at 17:14 ]
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
11楼2010-11-08 17:11:25
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-08 23:06:06
恒星年(金币+2):谢谢 2010-11-09 10:27:21
请问你的同源臂是多长，用的重组酶是体外用，还是宿主体内表达的重组酶。一般原核有这么强的重组能力吗？我表示怀疑哦。
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Thank-you，so-blue.
12楼2010-11-08 21:16:43
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):热心鼓励。 2010-11-10 10:20:51
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-11-08 21:16:43:
请问你的同源臂是多长，用的重组酶是体外用，还是宿主体内表达的重组酶。一般原核有这么强的重组能力吗？我表示怀疑哦。

重组臂23-25bp，重组酶可以从金斯特买成品（不过比较贵哦），重组完的质粒在Top10中扩增，完全没有问题
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13楼2010-11-10 10:11:18
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sunwei57

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议放弃该方案,成功几率非常小,如果你想试试可以双酶切不过不建议浪费时间,如果没的选只能单酶切进,别无他法
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14楼2012-03-17 12:01:11
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