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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于融合PCR的问题
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thendlee

金虫 (正式写手)

[求助] 关于融合PCR的问题

鄙人在做一个融合PCR，第一个片段约2KB，第二个片段约11KB，重合片段大约在80bp左右，我按照资料里介绍的方法，先分别P出两个独立的片段，然后再不加引物融合8--10个循环，最后拿中间产物加最上游和最下游的引物30循环，可是一直出不来结果，最后跑胶的时候（如图）还是出现两条独立的条带，加样孔倒是特别亮，会不会融合出一条特别长的片段呢？我将融合后的产物纯化回收过，跑胶时上样孔依然很亮，不知道是什么原因，求助各位大神。

注：孔1为15000的marker 孔2、3为融合PCR产物，孔4是另一个PCR产物的对照，以示别的加样孔并不亮

不加引物的体系为：
片段1                        3微升
片段2                        6微升
dNTP                         4
PS buffer                   10
水                 26.5
primestar                   0.5

98度10S   51.6度15S  72度10M  8个循环

加引物的体系
中间产物          5微升
dntp                        5
PS                           10
水                26.5
上游              1.5
下游              1.5
primestar                  0.5

98度10秒 52度15秒 72度11分半
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1楼2012-02-24 10:06:44
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feichen2008

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
thendlee(金币+2): ★有帮助 2012-03-01 15:48:13
两个片段的浓度要大概一致，浓度不要太高，50ng足够。另外长片段不是很好扩，最好选扩长片段的酶。祝好运！
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2楼2012-02-24 11:15:23
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
thendlee(金币+2): ★有帮助 说实话 我第一次做这个融合PCR的时候成功了 但是一个星期之后再做却怎么也出不来了 2012-03-01 15:49:16
建议不加引物不要51.6度那一步，PCR仪降温很快，快速降温会影响DNA复性，这可能就是造成加样空里面没有跑出来的原因。我做片段（8KB左右）融合时是把两个片段一起加进去做模板，直接做加引物PCR的那步，不过由于这个过程包括了不加引物的那步的退火，像你的都有80bp，所以退火温度用高点，60度以上，也可以两步，第一个有高温度退火5个循环，后面再用低温退火进行扩增。融合的两个片段最好大小差不多，摩尔量也差不多，有助于融合成功。
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3楼2012-02-24 13:53:45
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thendlee

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by feichen2008 at 2012-02-24 11:15:23:
两个片段的浓度要大概一致，浓度不要太高，50ng足够。另外长片段不是很好扩，最好选扩长片段的酶。祝好运！

我做了许多梯度 还是没有出来
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4楼2012-03-01 15:47:57
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feichen2008

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by thendlee at 2012-03-01 15:47:57:
我做了许多梯度 还是没有出来

有没有换个酶试一下。
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5楼2012-03-02 09:19:56
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feichen2008

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by feichen2008 at 2012-03-02 09:19:56:
有没有换个酶试一下。

你的片段太大，能不能考虑用酶切位点连？
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6楼2012-03-02 09:22:16
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feichen2008

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by feichen2008 at 2012-03-02 09:22:16:
你的片段太大，能不能考虑用酶切位点连？

我仔细看了你的RCR图，你融合之后的片段大小应该是13KB，你跑的带的大小不是也接近15KB的带了吗？你可以把最上面一条带回收回来测个序看看是不是你要的
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7楼2012-03-02 09:26:11
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
thendlee(金币+1): 2012-03-02 15:09:49
有的PCR仪有缓慢降温程序，比如0.1度/s， 适合overlap的退火

这个情况，片段如此长，我也觉得该考虑其他方法了
可以把11kb的片段分几段PCR出来，再一一拼起。
片段长度差不多的可能更容易拼接。
也可以利用片段天生的酶切位点，把几个片段连接。
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8楼2012-03-02 10:46:18
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thendlee

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by feichen2008 at 2012-03-02 09:19:56:
有没有换个酶试一下。

这个倒没有 准备试一下
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9楼2012-03-02 15:05:47
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thendlee

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gongeleven at 2012-03-02 10:46:18:
有的PCR仪有缓慢降温程序，比如0.1度/s， 适合overlap的退火

这个情况，片段如此长，我也觉得该考虑其他方法了
可以把11kb的片段分几段PCR出来，再一一拼起。
片段长度差不多的可能更容易拼接。
也可以利用 ...

我后面那个大片段其实就是酶切位点连的 在与第一个片段连接的时候 发现连不上去 板上什么都不长 所以才考虑融合PCR
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10楼2012-03-02 15:07:19
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