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jiaoxiayoulu

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[求助] 融合PCR请帮忙看看图片吧已有2人参与

我两个条带一个是1680bp；另一个是2550bp ,然后融合，第二轮PCR不加引物，其他同常规PCR；用的是LAtaq酶。融合之后既有融合片段，又有原始的两条片段！可是当我进行完第三轮pcr之后（此时加入的引物为2550bp上游引物和 1680bp的下游引物），跑胶发现第二轮pcr跑胶图片中原始条带2550bp不怎么亮的带，第三轮却是出奇的亮啊！而融合片段却不怎么亮，求解啊？（1KBmarker 和 Hind111）

第二轮pcr图片

第三轮PCR图片

[ Last edited by jiaoxiayoulu on 2014-3-5 at 17:14 ]

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1楼 2014-03-05 17:10:27

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鬼羽帝魂

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jiaoxiayoulu(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 01:10:11

第二轮PCR不加引物，其他同常规PCR，此时循环数设为7-8，然后加引物，扩增。
如需大量扩增，以第二轮的作为模板（1ul），进行扩增。可稍微提高下退火温度。

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2楼2014-03-05 17:14:50

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jiaoxiayoulu

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-05 17:14:50
第二轮PCR不加引物，其他同常规PCR，此时循环数设为7-8，然后加引物，扩增。
如需大量扩增，以第二轮的作为模板（1ul），进行扩增。可稍微提高下退火温度。

我第一轮没用高保真酶，用的普通taq酶！第二轮我设置了20个循环，目的是让他尽可能多的产生融合片段！第三轮PCR时我以第二轮产物（没做胶回收，也没有纯化）为模板，左边条带为取了10ul二轮产物，右边条带我是取了5ul二轮产物为模板。我想知道，为什么二轮PCR小条带很亮，而三轮PCR大条带却很亮？？？？？？？

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3楼2014-03-05 18:08:25

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