应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 融合pcr怎么总是不成功啊
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
101/1返回列表
查看: 5398  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)

[求助] 融合pcr怎么总是不成功啊

最近想将1100bp左右的两个片段通过融合pcr形成一个2200bp大小的目的片段，做个几次OVERLAPPING PCR ,开始是p不出目的条带，好不容易p出目的条带连到pMD18T上送去测序，结果只有一段600bp是我期中的一条目的片段的序列。不知道是为什么？请做过融合pcr的同志们指教，不胜感激。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2011-05-16 20:06:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)
★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-16 20:59:25
最好可以提供体系和程序，我用的是Takara的primerstar 酶
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-05-16 20:12:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

牵着猎人的狼(金币+1): 2011-05-19 23:00:57
楼主，只有一点要注意，模板一定要浓，加的量要大，这个和普通PCR不同的地方，10UL体系你模板加到100NG，绝对能出来，但回收条带里面会有些混杂的带，可以做二次PCR
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-05-17 18:34:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

牵着猎人的狼(金币+1): 2011-05-19 23:00:52
鉴于楼主的情况，最好能够先将这两个片段放入克隆载体，然后用这两个载体做模板进行融合PCR，选用一些保真性好，而且扩增效率又高的酶
赞一下 回复此楼
4楼2011-05-17 23:52:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

另外，不知楼主用于做模板的两个片段是否经过琼脂糖纯化，直接用PCR产物做模板虽说也可以，但效果不如前者好
赞一下 回复此楼
5楼2011-05-17 23:55:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)
dhd997: 对于你的问题可以再一楼编辑，也可以引用回复，可以及时让虫友看到。 2011-05-20 08:30:55
我第一轮pcr的模板是连结目的条带的pMD-18T载体，第二轮用的是pcr产物，没有回收，这样可以p出与overlapping大小相同的条带，但是测序结果总是不对。
第二轮以第一轮回收产物为模板，稀释50倍，和没有稀释均没有带。
不知道楼上的所说的高保真的酶是什么，我觉得Takara 的 primerstar 不太好用，不知道有没有什么好的推荐，不胜感激。
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2011-05-19 23:00:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cellline

木虫 (正式写手)
高保真的酶很多，比如全式金的fastpfu,这个酶还可以试试，不知你地处何处，可以看看其他公司相类似的酶。
赞一下 回复此楼
7楼2011-05-20 12:46:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mxlo.o

金虫 (正式写手)
引用回帖:
1261106楼: Originally posted by shaquila at 2011-05-17 18:34:34
楼主，只有一点要注意，模板一定要浓，加的量要大，这个和普通PCR不同的地方，10UL体系你模板加到100NG，绝对能出来，但回收条带里面会有些混杂的带，可以做二次PCR

我看了很多的帖子，一般要求混合的比例是1:1，但是我对1：1还有些疑问，不知能否给予解答。1：1指的是DNA片段的总浓度呢，还是片段的分子摩尔数。比如说，一个3kb的片段和1.5kb的片段，在浓度相同的情况下，其分子摩尔数应该是不一样的吧。那么应采用哪一个呢？
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-28 09:24:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

njauwxl

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by mxlo.o at 2012-05-28 09:24:04
我看了很多的帖子，一般要求混合的比例是1:1，但是我对1：1还有些疑问，不知能否给予解答。1：1指的是DNA片段的总浓度呢，还是片段的分子摩尔数。比如说，一个3kb的片段和1.5kb的片段，在浓度相同的情况下，其分子 ...

肯定是分子摩尔数
赞一下 回复此楼
9楼2014-08-05 11:15:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nirui466

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
10楼2015-05-14 20:37:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 牵着猎人的狼 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0854求调剂 +4 assdll 2026-04-04 4/200 2026-04-05 09:44 by zhq0425
[考研] 313求调剂 +3 海日海日 2026-04-04 3/150 2026-04-05 07:57 by 544594351
[考研] 调剂 +11 JLLLLLLLLLL 2026-04-03 11/550 2026-04-04 22:21 by hemengdong
[考研] 材料科学与工程调剂 +19 深V宿舍吧 2026-03-30 20/1000 2026-04-04 22:13 by hemengdong
[考研] 349求调剂 +11 zwjjjjjj 2026-03-31 11/550 2026-04-04 19:52 by 蓝云思雨
[考研] 本科211，专业085404，293分请求调剂 +5 莲菜就是藕吧 2026-04-04 5/250 2026-04-04 14:08 by 这是一个无聊的�
[考研] 357求调剂 +13 1050389037 2026-04-03 13/650 2026-04-03 22:27 by 无际的草原
[考研] 机械专硕297 +3 Afksy 2026-04-03 3/150 2026-04-03 14:24 by 1753564080
[考研] 366求调剂 +7 sbdnd 2026-04-03 7/350 2026-04-03 12:40 by cymywx
[考研] 土木304求调剂 +4 兔突突突， 2026-04-02 5/250 2026-04-02 21:16 by 兔突突突，
[考研] 282求调剂 +13 呼吸都是减肥 2026-04-01 13/650 2026-04-02 14:10 by baoball
[考研] 285求调剂 +11 AZMK 2026-04-01 11/550 2026-04-01 22:40 by peike
[考研] 085602化学工程268分蹲调剂 +8 月照花林。 2026-04-01 8/400 2026-04-01 22:08 by 无际的草原
[考研] 265求调剂 +11 yelck 2026-04-01 12/600 2026-04-01 19:12 by 549790059
[考研] 材料专业调剂 +5 啦啦啦哭 2026-03-31 6/300 2026-04-01 16:48 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +4 图鉴212 2026-03-30 5/250 2026-04-01 15:32 by 图鉴212
[考研] 322求调剂 +8 三水sss 2026-04-01 8/400 2026-04-01 10:19 by 唐沐儿
[考研] 358求调剂 +3 王向阳花 2026-03-31 3/150 2026-04-01 09:56 by zzchen2000
[考研] 301求调剂 +8 axibli 2026-04-01 8/400 2026-04-01 09:51 by 我的船我的海
[考研] 0710生物学求调剂！ +6 叙述文 2026-03-31 6/300 2026-04-01 09:39 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭