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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)

[求助] 融合pcr怎么总是不成功啊

最近想将1100bp左右的两个片段通过融合pcr形成一个2200bp大小的目的片段,做个几次OVERLAPPING PCR ,开始是p不出目的条带,好不容易p出目的条带连到pMD18T上送去测序,结果只有一段600bp是我期中的一条目的片段的序列。不知道是为什么?请做过融合pcr的同志们指教,不胜感激。
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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-16 20:59:25
最好可以提供体系和程序,我用的是Takara的primerstar 酶
2楼2011-05-16 20:12:14
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

牵着猎人的狼(金币+1): 2011-05-19 23:00:57
楼主,只有一点要注意,模板一定要浓,加的量要大,这个和普通PCR不同的地方,10UL体系你模板加到100NG,绝对能出来,但回收条带里面会有些混杂的带,可以做二次PCR
3楼2011-05-17 18:34:34
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

牵着猎人的狼(金币+1): 2011-05-19 23:00:52
鉴于楼主的情况,最好能够先将这两个片段放入克隆载体,然后用这两个载体做模板进行融合PCR,选用一些保真性好,而且扩增效率又高的酶
4楼2011-05-17 23:52:34
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

另外,不知楼主用于做模板的两个片段是否经过琼脂糖纯化,直接用PCR产物做模板虽说也可以,但效果不如前者好
5楼2011-05-17 23:55:03
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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)

dhd997: 对于你的问题可以再一楼编辑,也可以引用回复,可以及时让虫友看到。 2011-05-20 08:30:55
我第一轮pcr的模板是连结目的条带的pMD-18T载体,第二轮用的是pcr产物,没有回收,这样可以p出与overlapping大小相同的条带,但是测序结果总是不对。
第二轮以第一轮回收产物为模板,稀释50倍,和没有稀释均没有带。
不知道楼上的所说的高保真的酶是什么,我觉得Takara 的 primerstar 不太好用,不知道有没有什么好的推荐,不胜感激。
6楼2011-05-19 23:00:16
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cellline

木虫 (正式写手)

高保真的酶很多,比如全式金的fastpfu,这个酶还可以试试,不知你地处何处,可以看看其他公司相类似的酶。
7楼2011-05-20 12:46:01
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mxlo.o

金虫 (正式写手)

引用回帖:
1261106楼: Originally posted by shaquila at 2011-05-17 18:34:34
楼主,只有一点要注意,模板一定要浓,加的量要大,这个和普通PCR不同的地方,10UL体系你模板加到100NG,绝对能出来,但回收条带里面会有些混杂的带,可以做二次PCR

我看了很多的帖子,一般要求混合的比例是1:1,但是我对1:1还有些疑问,不知能否给予解答。1:1指的是DNA片段的总浓度呢,还是片段的分子摩尔数。比如说,一个3kb的片段和1.5kb的片段,在浓度相同的情况下,其分子摩尔数应该是不一样的吧。那么应采用哪一个呢?
8楼2012-05-28 09:24:04
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njauwxl

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by mxlo.o at 2012-05-28 09:24:04
我看了很多的帖子,一般要求混合的比例是1:1,但是我对1:1还有些疑问,不知能否给予解答。1:1指的是DNA片段的总浓度呢,还是片段的分子摩尔数。比如说,一个3kb的片段和1.5kb的片段,在浓度相同的情况下,其分子 ...

肯定是分子摩尔数
9楼2014-08-05 11:15:20
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nirui466

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

10楼2015-05-14 20:37:12
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