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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 融合pcr怎么总是不成功啊
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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)

[求助] 融合pcr怎么总是不成功啊

最近想将1100bp左右的两个片段通过融合pcr形成一个2200bp大小的目的片段，做个几次OVERLAPPING PCR ,开始是p不出目的条带，好不容易p出目的条带连到pMD18T上送去测序，结果只有一段600bp是我期中的一条目的片段的序列。不知道是为什么？请做过融合pcr的同志们指教，不胜感激。
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1楼2011-05-16 20:06:31
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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)
★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-16 20:59:25
最好可以提供体系和程序，我用的是Takara的primerstar 酶
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2楼2011-05-16 20:12:14
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

牵着猎人的狼(金币+1): 2011-05-19 23:00:57
楼主，只有一点要注意，模板一定要浓，加的量要大，这个和普通PCR不同的地方，10UL体系你模板加到100NG，绝对能出来，但回收条带里面会有些混杂的带，可以做二次PCR
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3楼2011-05-17 18:34:34
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

牵着猎人的狼(金币+1): 2011-05-19 23:00:52
鉴于楼主的情况，最好能够先将这两个片段放入克隆载体，然后用这两个载体做模板进行融合PCR，选用一些保真性好，而且扩增效率又高的酶
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4楼2011-05-17 23:52:34
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

另外，不知楼主用于做模板的两个片段是否经过琼脂糖纯化，直接用PCR产物做模板虽说也可以，但效果不如前者好
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5楼2011-05-17 23:55:03
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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)
dhd997: 对于你的问题可以再一楼编辑，也可以引用回复，可以及时让虫友看到。 2011-05-20 08:30:55
我第一轮pcr的模板是连结目的条带的pMD-18T载体，第二轮用的是pcr产物，没有回收，这样可以p出与overlapping大小相同的条带，但是测序结果总是不对。
第二轮以第一轮回收产物为模板，稀释50倍，和没有稀释均没有带。
不知道楼上的所说的高保真的酶是什么，我觉得Takara 的 primerstar 不太好用，不知道有没有什么好的推荐，不胜感激。
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6楼2011-05-19 23:00:16
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cellline

木虫 (正式写手)
高保真的酶很多，比如全式金的fastpfu,这个酶还可以试试，不知你地处何处，可以看看其他公司相类似的酶。
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7楼2011-05-20 12:46:01
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mxlo.o

金虫 (正式写手)
引用回帖:
1261106楼: Originally posted by shaquila at 2011-05-17 18:34:34
楼主，只有一点要注意，模板一定要浓，加的量要大，这个和普通PCR不同的地方，10UL体系你模板加到100NG，绝对能出来，但回收条带里面会有些混杂的带，可以做二次PCR

我看了很多的帖子，一般要求混合的比例是1:1，但是我对1：1还有些疑问，不知能否给予解答。1：1指的是DNA片段的总浓度呢，还是片段的分子摩尔数。比如说，一个3kb的片段和1.5kb的片段，在浓度相同的情况下，其分子摩尔数应该是不一样的吧。那么应采用哪一个呢？
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8楼2012-05-28 09:24:04
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njauwxl

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by mxlo.o at 2012-05-28 09:24:04
我看了很多的帖子，一般要求混合的比例是1:1，但是我对1：1还有些疑问，不知能否给予解答。1：1指的是DNA片段的总浓度呢，还是片段的分子摩尔数。比如说，一个3kb的片段和1.5kb的片段，在浓度相同的情况下，其分子 ...

肯定是分子摩尔数
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9楼2014-08-05 11:15:20
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nirui466

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
10楼2015-05-14 20:37:12
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