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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

[求助] 融合PCR最后一步做不出来，求救！！！

做3片段的融合PCR，左翼片段、抗性片段、右翼片段分别是800、2000、800bp，分别割胶回收后的浓度大约是70、120、70纳克/微升。
按摩尔比1:3:1的比例进行融合，第一个步10个循环，94度 30秒；57度 30秒；72度 4分钟，第一步用的是Pfu酶。
第二步取第一步的产物1微升作为模板，两侧F1、R2各2微升，5微升buffer，1微升dNTP(10mM)，0.5微升Ex taq.   第二步与第一步的反应温度一样，28个循环。

最后跑出来的条带很混乱，我的目的条带应该在3800左右，可是跑胶得到的条带好像被分解了一样，全都在1000左右。
求助各位达人，这是在哪里出了问题？



上图右向左数第三道就是我说的融合后产物跑胶结果。
融合PCR最后一步做不出来，求救！！！
预融合产物稀释1、10、100倍融合 2013-08-20 10 小时 02 分钟.jpg
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1楼 2013-09-26 19:50:41
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lcat

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 20:41:16
gyesang: 回帖置顶 2013-09-28 20:41:19
我们的经验：
1. 融合时做退火温度梯度，退货时间可延长至长达3-5 min（原理我也不清楚）；
2. 最后一次pcr时，不用原来扩侧翼片段的那两条最外侧引物，而是新设计一对位置略靠近内部一点的巢式引物。这个非常管用，但你的情况这样做的话可能就需要重新扩侧翼片段了。
3. 扩片段、融合用Pfu，最后一次pcr可以用高效的Taq类酶。
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14楼2013-09-28 05:08:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 17:20:08
引用回帖:
6楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-09-26 20:28:15
现在有个情况，就是我可以融合上左翼片段和抗性基因、右翼片段和抗性基因。
今天试了一下用这两组片段进行1：1的融合，还是不行啊。

可以尝试用T4 DNA聚合酶或T5 DNA外切酶在没有dNTP的情况下处理后在聚合，连接，具体搜索LIC克隆和Gibson 。
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为什么
10楼2013-09-27 00:01:15
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普通回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-26 20:41:18
建议提高退火温度到59.
我做融合PCR不分第一第二步的, 我会把所有片段和两端的引物加好然后跑一次PCR(当然用pfu). 楼主可以参考.
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2楼2013-09-26 19:59:06
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-09-26 19:59:06
建议提高退火温度到59.
我做融合PCR不分第一第二步的, 我会把所有片段和两端的引物加好然后跑一次PCR(当然用pfu). 楼主可以参考.

请问你也是融合3片段吗？
用PFU酶的话延伸的时间那么长是不是需要加大dNTP的量呢？
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3楼2013-09-26 20:04:05
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 17:19:44
中间片段用太多了吧，减少为现在的1/10就可以了。第二步的模板可以做个梯度，现在的可能还是多了。
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为什么
4楼2013-09-26 20:13:07
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 547star at 2013-09-26 20:13:07
中间片段用太多了吧，减少为现在的1/10就可以了。第二步的模板可以做个梯度，现在的可能还是多了。

楼主说的是按摩尔比加入的，为什么大片段的要少加呢？？
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5楼2013-09-26 20:23:13
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
现在有个情况，就是我可以融合上左翼片段和抗性基因、右翼片段和抗性基因。
今天试了一下用这两组片段进行1：1的融合，还是不行啊。
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6楼2013-09-26 20:28:15
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-09-26 20:28:15
现在有个情况，就是我可以融合上左翼片段和抗性基因、右翼片段和抗性基因。
今天试了一下用这两组片段进行1：1的融合，还是不行啊。

密切关注中，我已经做了两个月，至今无果。。。
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7楼2013-09-26 20:29:21
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-09-26 20:29:21
密切关注中，我已经做了两个月，至今无果。。。...

握手……
我也是做了2个月了，目前的进度最远就是只能其中两个片段融合上，三个片段很难融合，能问问你是遇到什么问题吗？
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8楼2013-09-26 20:41:22
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-09-26 20:41:22
握手……
我也是做了2个月了，目前的进度最远就是只能其中两个片段融合上，三个片段很难融合，能问问你是遇到什么问题吗？...

同样的问题，我也是到你的这一步，然后再融合的时候就一直弥散，刚开始我觉得可能是我的引物纯化方式有问题，后来就换了HPLC，但是还是没有成功，而且目前的问题还多了一个，那就是以两两融合的片段为模板，无法得到扩增。所以现在也在找方法。
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9楼2013-09-26 20:51:54
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