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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 融合PCR最后一步做不出来，求救！！！
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-10 15:17:21
你可以先两两融合，不要三个一起融合

两两融合的方案有
左+中 融合胶回收，再跟右融合
左+中融合胶回收，中+右融合胶回收，上两步融合胶回收
中+右融合胶回收，再跟左融合
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11楼2013-09-27 17:22:25
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by gyesang at 2013-09-27 17:22:25
你可以先两两融合，不要三个一起融合

两两融合的方案有
左+中 融合胶回收，再跟右融合
左+中融合胶回收，中+右融合胶回收，上两步融合胶回收
中+右融合胶回收，再跟左融合

我想请问一下，这些方案中每一步都要用Pfu酶嘛？因为Pfu扩增的速度较慢，我之前做融合的时候，预融合用Pfu酶，融合用Taq plus(taq+Pfu).
理论上Taq plus的扩增速度跟Taq一样，而且保真性较Taq好，但是会加上A尾，这个对融合的影响会不会很大？
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12楼2013-09-27 21:55:30
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-09-27 21:55:30
我想请问一下，这些方案中每一步都要用Pfu酶嘛？因为Pfu扩增的速度较慢，我之前做融合的时候，预融合用Pfu酶，融合用Taq plus(taq+Pfu).
理论上Taq plus的扩增速度跟Taq一样，而且保真性较Taq好，但是会加上A尾， ...

必须PFU，循环小一点就可以了18-25个都可以，循环越少突变的概率就越小哈
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
13楼2013-09-28 01:58:34
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lcat

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 20:41:16
gyesang: 回帖置顶 2013-09-28 20:41:19
我们的经验：
1. 融合时做退火温度梯度，退货时间可延长至长达3-5 min（原理我也不清楚）；
2. 最后一次pcr时，不用原来扩侧翼片段的那两条最外侧引物，而是新设计一对位置略靠近内部一点的巢式引物。这个非常管用，但你的情况这样做的话可能就需要重新扩侧翼片段了。
3. 扩片段、融合用Pfu，最后一次pcr可以用高效的Taq类酶。
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14楼2013-09-28 05:08:31
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

嘿，哥们，我已经做出来了，不知道你的情况怎么样？可以交流交流我感觉我找到方法了
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15楼2013-10-02 21:21:40
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-10-02 21:21:40
嘿，哥们，我已经做出来了，不知道你的情况怎么样？可以交流交流我感觉我找到方法了

我师姐们。
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16楼2013-10-06 22:26:39
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-10-06 22:26:39
我师姐们。...

什么？不明白你的话啊
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17楼2013-10-07 11:05:33
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-10-07 11:05:33
什么？不明白你的话啊...

不好意思啊，那个可能是我师弟用我的号发的
你成功了？交流一下经验吧~！
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18楼2013-10-09 09:46:13
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-10 15:17:33
引用回帖:
18楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-10-09 09:46:13
不好意思啊，那个可能是我师弟用我的号发的
你成功了？交流一下经验吧~！...

第一，摩尔比的问题，如果两个片段大小接近，那就近似1:1:1，如果片段大小不一样，那就要把小片段的量加大，摩尔比接近1.5:1左右；
第二，还有就是加入的模板浓度，一般体系里的模板终浓度要大于1ng/ul；
第三，就是PCR的程序了，要先进行6个低温的cycles，这个温度以你扩增单片段时和模板match的部分为准，
第四，引物的纯化方式要好点，最低PAGE
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19楼2013-10-09 15:17:30
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
19楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-10-09 15:17:30
第一，摩尔比的问题，如果两个片段大小接近，那就近似1:1:1，如果片段大小不一样，那就要把小片段的量加大，摩尔比接近1.5:1左右；
第二，还有就是加入的模板浓度，一般体系里的模板终浓度要大于1ng/ul；
第三， ...


感谢啊~这个经验总结得很好呢
我昨天终于跑出条带了，确实是模板浓度和比例很重要
我用的酶是TAKARA的primerstar max
现在有个问题，我想连接载体，但是产物是平末端的，不知道你是否了解平末端那个载体比较容易连接上？
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20楼2013-10-10 15:14:08
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