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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-10 15:17:21
你可以先两两融合,不要三个一起融合

两两融合的方案有
左+中 融合胶回收,再跟右融合
左+中融合胶回收,中+右融合胶回收,上两步融合胶回收
中+右融合胶回收,再跟左融合
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
11楼2013-09-27 17:22:25
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
11楼: Originally posted by gyesang at 2013-09-27 17:22:25
你可以先两两融合,不要三个一起融合

两两融合的方案有
左+中 融合胶回收,再跟右融合
左+中融合胶回收,中+右融合胶回收,上两步融合胶回收
中+右融合胶回收,再跟左融合

我想请问一下,这些方案中每一步都要用Pfu酶嘛?因为Pfu扩增的速度较慢,我之前做融合的时候,预融合用Pfu酶,融合用Taq plus(taq+Pfu).
理论上Taq plus的扩增速度跟Taq一样,而且保真性较Taq好,但是会加上A尾,这个对融合的影响会不会很大?
12楼2013-09-27 21:55:30
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-09-27 21:55:30
我想请问一下,这些方案中每一步都要用Pfu酶嘛?因为Pfu扩增的速度较慢,我之前做融合的时候,预融合用Pfu酶,融合用Taq plus(taq+Pfu).
理论上Taq plus的扩增速度跟Taq一样,而且保真性较Taq好,但是会加上A尾, ...

必须PFU,循环小一点就可以了18-25个都可以,循环越少突变的概率就越小哈
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
13楼2013-09-28 01:58:34
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lcat

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2013-09-28 20:41:16
gyesang: 回帖置顶 2013-09-28 20:41:19
我们的经验:
1. 融合时做退火温度梯度,退货时间可延长至长达3-5 min(原理我也不清楚);
2. 最后一次pcr时,不用原来扩侧翼片段的那两条最外侧引物,而是新设计一对位置略靠近内部一点的巢式引物。这个非常管用,但你的情况这样做的话可能就需要重新扩侧翼片段了。
3. 扩片段、融合用Pfu,最后一次pcr可以用高效的Taq类酶。
14楼2013-09-28 05:08:31
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

嘿,哥们,我已经做出来了,不知道你的情况怎么样?可以交流交流我感觉我找到方法了
15楼2013-10-02 21:21:40
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
15楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-10-02 21:21:40
嘿,哥们,我已经做出来了,不知道你的情况怎么样?可以交流交流我感觉我找到方法了

我师姐们。
16楼2013-10-06 22:26:39
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-10-06 22:26:39
我师姐们。...

什么?不明白你的话啊
17楼2013-10-07 11:05:33
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
17楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-10-07 11:05:33
什么?不明白你的话啊...

不好意思啊,那个可能是我师弟用我的号发的
你成功了?交流一下经验吧~!
18楼2013-10-09 09:46:13
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-10 15:17:33
引用回帖:
18楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-10-09 09:46:13
不好意思啊,那个可能是我师弟用我的号发的
你成功了?交流一下经验吧~!...

第一,摩尔比的问题,如果两个片段大小接近,那就近似1:1:1,如果片段大小不一样,那就要把小片段的量加大,摩尔比接近1.5:1左右;
第二,还有就是加入的模板浓度,一般体系里的模板终浓度要大于1ng/ul;
第三,就是PCR的程序了,要先进行6个低温的cycles,这个温度以你扩增单片段时和模板match的部分为准,
第四,引物的纯化方式要好点,最低PAGE
19楼2013-10-09 15:17:30
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
19楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-10-09 15:17:30
第一,摩尔比的问题,如果两个片段大小接近,那就近似1:1:1,如果片段大小不一样,那就要把小片段的量加大,摩尔比接近1.5:1左右;
第二,还有就是加入的模板浓度,一般体系里的模板终浓度要大于1ng/ul;
第三, ...


感谢啊~这个经验总结得很好呢
我昨天终于跑出条带了,确实是模板浓度和比例很重要
我用的酶是TAKARA的primerstar max
现在有个问题,我想连接载体,但是产物是平末端的,不知道你是否了解平末端那个载体比较容易连接上?
20楼2013-10-10 15:14:08
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