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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 融合PCR最后一步做不出来，求救！！！

做3片段的融合PCR，左翼片段、抗性片段、右翼片段分别是800、2000、800bp，分别割胶回收后的浓度大约是70、120、70纳克/微升。
按摩尔比1:3:1的比例进行融合，第一个步10个循环，94度 30秒；57度 30秒；72度 4分钟，第一步用的是Pfu酶。
第二步取第一步的产物1微升作为模板，两侧F1、R2各2微升，5微升buffer，1微升dNTP(10mM)，0.5微升Ex taq. 第二步与第一步的反应温度一样，28个循环。

最后跑出来的条带很混乱，我的目的条带应该在3800左右，可是跑胶得到的条带好像被分解了一样，全都在1000左右。
求助各位达人，这是在哪里出了问题？

上图右向左数第三道就是我说的融合后产物跑胶结果。

预融合产物稀释1、10、100倍融合 2013-08-20 10 小时 02 分钟.jpg

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1楼 2013-09-26 19:50:41

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lcat

木虫 (小有名气)

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专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 20:41:16
gyesang: 回帖置顶 2013-09-28 20:41:19

我们的经验：
1. 融合时做退火温度梯度，退货时间可延长至长达3-5 min（原理我也不清楚）；
2. 最后一次pcr时，不用原来扩侧翼片段的那两条最外侧引物，而是新设计一对位置略靠近内部一点的巢式引物。这个非常管用，但你的情况这样做的话可能就需要重新扩侧翼片段了。
3. 扩片段、融合用Pfu，最后一次pcr可以用高效的Taq类酶。