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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 融合PCR最后一步做不出来，求救！！！
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

[求助] 融合PCR最后一步做不出来，求救！！！

做3片段的融合PCR，左翼片段、抗性片段、右翼片段分别是800、2000、800bp，分别割胶回收后的浓度大约是70、120、70纳克/微升。
按摩尔比1:3:1的比例进行融合，第一个步10个循环，94度 30秒；57度 30秒；72度 4分钟，第一步用的是Pfu酶。
第二步取第一步的产物1微升作为模板，两侧F1、R2各2微升，5微升buffer，1微升dNTP(10mM)，0.5微升Ex taq.   第二步与第一步的反应温度一样，28个循环。

最后跑出来的条带很混乱，我的目的条带应该在3800左右，可是跑胶得到的条带好像被分解了一样，全都在1000左右。
求助各位达人，这是在哪里出了问题？



上图右向左数第三道就是我说的融合后产物跑胶结果。
融合PCR最后一步做不出来，求救！！！
预融合产物稀释1、10、100倍融合 2013-08-20 10 小时 02 分钟.jpg
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1楼 2013-09-26 19:50:41
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 17:19:44
中间片段用太多了吧，减少为现在的1/10就可以了。第二步的模板可以做个梯度，现在的可能还是多了。
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为什么
4楼2013-09-26 20:13:07
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 17:20:08
引用回帖:
6楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-09-26 20:28:15
现在有个情况，就是我可以融合上左翼片段和抗性基因、右翼片段和抗性基因。
今天试了一下用这两组片段进行1：1的融合，还是不行啊。

可以尝试用T4 DNA聚合酶或T5 DNA外切酶在没有dNTP的情况下处理后在聚合，连接，具体搜索LIC克隆和Gibson 。
赞一下(1人) 回复此楼
为什么
10楼2013-09-27 00:01:15
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