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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平末端连接，连上了，很多转化子中没有一个正确的，怎么办？
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zld629

木虫 (小有名气)

[求助] 平末端连接，连上了，很多转化子中没有一个正确的，怎么办？

在构建一个载体到了最后一步平末端连接，总是不成功。转化后长了不少菌，挑了100多那个，几乎整板都挑了，没有一个对的。怎么办？我用载体上片段做正引物、插入片段末端做反引物，做PCR，连接液有很亮的带，应该是有连上的了，为什么转化子中却没有？如何解决这个问题呢？
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1楼 2012-06-24 19:24:40
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zld629

木虫 (小有名气)
补充一下：我的载体是用PMEI酶切的，片段是用高保真PCR的；也试过连接液中加入PMEI,长了7个菌，以为是的了，结果一PCR验证，还不是。都做了两个月了，崩溃中
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2楼2012-06-24 19:40:10
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chen.qiqi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，很热心哦 2012-06-25 13:44:46
有可能是把载体转化进去的那一步操作不好，温度时间没有控制好。
也有可能选的菌比较难转化成功，毕竟转化的成功率一般都低。
你可以这么试试，结合载体的类型和大小，选用另外一种公认容易转化成功的菌，试试能不能转进去。如果能转进去，说明你之前的菌较难转化。如果不能转进去，说明载体其实没有链接好或者操作过程有问题。
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3楼2012-06-25 00:25:52
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陈帅印

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-25 13:44:56
先加A连接到t载体上，鉴定后酶切，再连接到目的载体上。实在不行试试In-Fusion克隆技术。http://wenku.baidu.com/view/5bb2f4a70029bd64783e2c60.html?st=1
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4楼2012-06-25 11:25:27
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syn1985

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不太懂你的检测方法 一般平末端不好连接 都是加A后再连的 如果浓度够 方法没问题都能连上
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5楼2012-06-25 12:41:24
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zld629

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by syn1985 at 2012-06-25 12:41:24
不太懂你的检测方法 一般平末端不好连接 都是加A后再连的 如果浓度够 方法没问题都能连上

我的筛选办法是：载体上选个正向引物，片段上选个反向引物，做PCR。你说的加A后再连，加A加在3‘端，就不是平末端了，能连上吗？浓度要达到多少呢？我们实验室的经验是载体浓度少一点好，多的反而长不出来。
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6楼2012-06-26 08:09:37
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zld629

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chen.qiqi at 2012-06-25 00:25:52
有可能是把载体转化进去的那一步操作不好，温度时间没有控制好。
也有可能选的菌比较难转化成功，毕竟转化的成功率一般都低。
你可以这么试试，结合载体的类型和大小，选用另外一种公认容易转化成功的菌，试试能不 ...

温度用的是42度，时间60S，90S都试过。感受态用的天根的DH5a和TOP10，商品化的，感觉问题不大。不过好像是转化的问题，因为之前做菌落PCR，有不亮的目的条带，是假阳性。
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7楼2012-06-26 08:14:08
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zld629

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 陈帅印 at 2012-06-25 11:25:27
先加A连接到t载体上，鉴定后酶切，再连接到目的载体上。实在不行试试In-Fusion克隆技术。http://wenku.baidu.com/view/5bb2f4a70029bd64783e2c60.html?st=1

IN-FUSION我本打算尝试的，可是第一步用PHUSION来做PCR做了一周死活做不出，就放弃了。能否请教一下这第一步的关2度键点在哪里？我根据网站上计算出来的TM值来做，第一轮用55度（做过梯度），第二轮用66、72度都做过。重现性极差。
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8楼2012-06-26 08:20:47
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zld629

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 陈帅印 at 2012-06-25 11:25:27
先加A连接到t载体上，鉴定后酶切，再连接到目的载体上。实在不行试试In-Fusion克隆技术。http://wenku.baidu.com/view/5bb2f4a70029bd64783e2c60.html?st=1

才发现以前的引物设计有问题，没有包括酶切位点的另一边。
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9楼2012-06-26 08:38:19
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chan_6217911

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体用pMEI处理后有没有进行去磷酸化处理，单酶切容易造成载体自连
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10楼2012-06-26 10:04:42
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