应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平末端连接，连上了，很多转化子中没有一个正确的，怎么办？
141/2返回列表12下一页
查看: 2383  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zld629

木虫 (小有名气)

[求助] 平末端连接，连上了，很多转化子中没有一个正确的，怎么办？

在构建一个载体到了最后一步平末端连接，总是不成功。转化后长了不少菌，挑了100多那个，几乎整板都挑了，没有一个对的。怎么办？我用载体上片段做正引物、插入片段末端做反引物，做PCR，连接液有很亮的带，应该是有连上的了，为什么转化子中却没有？如何解决这个问题呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-06-24 19:24:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zld629

木虫 (小有名气)
补充一下：我的载体是用PMEI酶切的，片段是用高保真PCR的；也试过连接液中加入PMEI,长了7个菌，以为是的了，结果一PCR验证，还不是。都做了两个月了，崩溃中
赞一下 回复此楼
2楼2012-06-24 19:40:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chen.qiqi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，很热心哦 2012-06-25 13:44:46
有可能是把载体转化进去的那一步操作不好，温度时间没有控制好。
也有可能选的菌比较难转化成功，毕竟转化的成功率一般都低。
你可以这么试试，结合载体的类型和大小，选用另外一种公认容易转化成功的菌，试试能不能转进去。如果能转进去，说明你之前的菌较难转化。如果不能转进去，说明载体其实没有链接好或者操作过程有问题。
赞一下 回复此楼
3楼2012-06-25 00:25:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

陈帅印

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-25 13:44:56
先加A连接到t载体上，鉴定后酶切，再连接到目的载体上。实在不行试试In-Fusion克隆技术。http://wenku.baidu.com/view/5bb2f4a70029bd64783e2c60.html?st=1
赞一下 回复此楼
4楼2012-06-25 11:25:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

syn1985

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不太懂你的检测方法 一般平末端不好连接 都是加A后再连的 如果浓度够 方法没问题都能连上
赞一下 回复此楼
5楼2012-06-25 12:41:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zld629

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by syn1985 at 2012-06-25 12:41:24
不太懂你的检测方法 一般平末端不好连接 都是加A后再连的 如果浓度够 方法没问题都能连上

我的筛选办法是：载体上选个正向引物，片段上选个反向引物，做PCR。你说的加A后再连，加A加在3‘端，就不是平末端了，能连上吗？浓度要达到多少呢？我们实验室的经验是载体浓度少一点好，多的反而长不出来。
赞一下 回复此楼
6楼2012-06-26 08:09:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zld629

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chen.qiqi at 2012-06-25 00:25:52
有可能是把载体转化进去的那一步操作不好，温度时间没有控制好。
也有可能选的菌比较难转化成功，毕竟转化的成功率一般都低。
你可以这么试试，结合载体的类型和大小，选用另外一种公认容易转化成功的菌，试试能不 ...

温度用的是42度，时间60S，90S都试过。感受态用的天根的DH5a和TOP10，商品化的，感觉问题不大。不过好像是转化的问题，因为之前做菌落PCR，有不亮的目的条带，是假阳性。
赞一下 回复此楼
7楼2012-06-26 08:14:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zld629

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 陈帅印 at 2012-06-25 11:25:27
先加A连接到t载体上，鉴定后酶切，再连接到目的载体上。实在不行试试In-Fusion克隆技术。http://wenku.baidu.com/view/5bb2f4a70029bd64783e2c60.html?st=1

IN-FUSION我本打算尝试的，可是第一步用PHUSION来做PCR做了一周死活做不出，就放弃了。能否请教一下这第一步的关2度键点在哪里？我根据网站上计算出来的TM值来做，第一轮用55度（做过梯度），第二轮用66、72度都做过。重现性极差。
赞一下 回复此楼
8楼2012-06-26 08:20:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zld629

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 陈帅印 at 2012-06-25 11:25:27
先加A连接到t载体上，鉴定后酶切，再连接到目的载体上。实在不行试试In-Fusion克隆技术。http://wenku.baidu.com/view/5bb2f4a70029bd64783e2c60.html?st=1

才发现以前的引物设计有问题，没有包括酶切位点的另一边。
赞一下 回复此楼
9楼2012-06-26 08:38:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chan_6217911

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体用pMEI处理后有没有进行去磷酸化处理，单酶切容易造成载体自连
赞一下 回复此楼
10楼2012-06-26 10:04:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zld629 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 5/250 2026-11-07 17:34 by Xc2FxHsHkBNc
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 5/250 2026-11-07 17:23 by Xc2FxHsHkBNc
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 5/250 2026-11-07 17:01 by Xc2FxHsHkBNc
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 5/250 2026-11-07 16:06 by Xc2FxHsHkBNc
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 6/300 2026-11-07 15:44 by Xc2FxHsHkBNc
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +3 yexuqing 2026-11-04 5/250 2026-11-07 13:22 by 苏东坡二世
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 23/1150 2026-11-07 06:49 by Equinoxhua
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +10 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 17:18 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 8/400 2026-11-06 16:34 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:32 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 12/600 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:36 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 5/250 2026-11-06 09:01 by 2lRNluKrJpwL
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 04:47 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[基金申请] 各位基础老师们，看完中央《从严治党》的决定后，对学术界更加有信心了吧 +5 iaeyuan 2026-11-01 5/250 2026-11-04 14:43 by jinchengzi
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭