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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆基因连接到载体上测序发现有一个点突变怎么办？
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wendaojue

铜虫 (著名写手)

[求助] 克隆基因连接到载体上测序发现有一个点突变怎么办？

克隆基因连接到载体上测序发现有一个点突变怎么办？
做了好几个连接，都连上了，但是测序发现有一个点突变，用什么方法能去除呢？
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1楼 2011-06-17 21:34:59
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-06-18 10:04:25
重新克隆吧~
或者用点突变试剂盒，不过这个太贵。
建议你克隆基因的时候选用高保真的酶，这样突变概率比较小。也不会比普通酶贵很多。
如果克隆的顺利的话 ，应该很块的，实在是不想重新克隆，那做点突变也很耗时间，耗钱。也可以用突变PCR，然后拼接。
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2楼2011-06-17 21:51:42
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zougx810

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励新虫交流 2011-06-18 10:04:45
一、选择高保真的酶做PCR扩增
二、多选择几个单克隆去测序
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3楼2011-06-17 21:53:39
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

dhd997(EPI+1): 2011-06-18 09:26:11
wendaojue(金币+2): 谢谢！ 2011-06-22 16:39:43
1:首先看楼主是做什么用了，做什么用很关键的，你如果想表达蛋白，那么重新克隆吧。。。如果是做敲除，构建重组载体，那大可不必。

2：其实见第一条，已经说了，目的不同，操作不同，思路也不同；

3：祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-06-17 21:59:40
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-17 21:59:40:
1:首先看楼主是做什么用了，做什么用很关键的，你如果想表达蛋白，那么重新克隆吧。。。如果是做敲除，构建重组载体，那大可不必。

2：其实见第一条，已经说了，目的不同，操作不同，思路也不同；

3：祝好运！

我觉得他是做表达，不是敲除重组，要不然不会这纠结。

表达或者是重组都需要重做的。重组敲除未必，看样子不像做敲除啊

我现在做的和你有点相似，就是把载体上的基因连带启动子一起重组到基因组上。

祝实验成功！
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5楼2011-06-17 23:23:38
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-06-17 23:23:38:
我觉得他是做表达，不是敲除重组，要不然不会这纠结。

表达或者是重组都需要重做的。重组敲除未必，看样子不像做敲除啊

我现在做的和你有点相似，就是把载体上的基因连带启动子一起重组到基因组上。

...

我？我现在不做这个，我现在做的很多。。。。那个东西我原来做过而已。。。呵呵！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-06-18 10:26:29
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

从新克隆吧！
我构建的一个载体，都从新做过好几次了
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开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。
7楼2011-06-18 15:23:56
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匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
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8楼2011-06-18 16:48:59
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啮风

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 欢迎应助 2011-06-19 12:19:49
克隆出现点突变很正常的啊，如果是做表达，只要你翻译的蛋白序列正确就OK了，毕竟很多氨基酸有多个密码子，核苷酸序列又不一定要100%相同。
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9楼2011-06-18 23:57:17
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 好方法。不过overlaping PCR不容易上手。 2011-06-22 16:30:17
做了几次构建，都有相同的突变
那大概就是模板突变了
很简单的处理方法，分两段PCR，用引物修正突变位置，最后overlap在一起。
直接把质粒P下来的点突变方法也OK，不需要买试剂盒，多看看相关文献和经验就行
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10楼2011-06-21 11:46:17
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