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wendaojue

铜虫 (著名写手)

[求助] 克隆基因连接到载体上测序发现有一个点突变怎么办?

克隆基因连接到载体上测序发现有一个点突变怎么办?
做了好几个连接,都连上了,但是测序发现有一个点突变,用什么方法能去除呢?
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-06-18 10:04:25
重新克隆吧~
或者用点突变试剂盒,不过这个太贵。
建议你克隆基因的时候选用高保真的酶,这样突变概率比较小。也不会比普通酶贵很多。
如果克隆的顺利的话 ,应该很块的,实在是不想重新克隆,那做点突变也很耗时间,耗钱。也可以用突变PCR,然后拼接。
2楼2011-06-17 21:51:42
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zougx810

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励新虫交流 2011-06-18 10:04:45
一、选择高保真的酶做PCR扩增
二、多选择几个单克隆去测序
3楼2011-06-17 21:53:39
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

dhd997(EPI+1): 2011-06-18 09:26:11
wendaojue(金币+2): 谢谢! 2011-06-22 16:39:43
1:首先看楼主是做什么用了,做什么用很关键的,你如果想表达蛋白,那么重新克隆吧。。。如果是做敲除,构建重组载体,那大可不必。

2:其实见第一条,已经说了,目的不同,操作不同,思路也不同;

3:祝好运!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-06-17 21:59:40
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-17 21:59:40:
1:首先看楼主是做什么用了,做什么用很关键的,你如果想表达蛋白,那么重新克隆吧。。。如果是做敲除,构建重组载体,那大可不必。

2:其实见第一条,已经说了,目的不同,操作不同,思路也不同;

3:祝好运!

我觉得他是做表达,不是敲除重组,要不然不会这纠结。

表达或者是重组都需要重做的。重组敲除未必,看样子不像做敲除啊

我现在做的和你有点相似,就是把载体上的基因连带启动子一起重组到基因组上。

祝实验成功!
5楼2011-06-17 23:23:38
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-06-17 23:23:38:
我觉得他是做表达,不是敲除重组,要不然不会这纠结。

表达或者是重组都需要重做的。重组敲除未必,看样子不像做敲除啊

我现在做的和你有点相似,就是把载体上的基因连带启动子一起重组到基因组上。

...

我?我现在不做这个,我现在做的很多。。。。那个东西我原来做过而已。。。呵呵!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-06-18 10:26:29
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

从新克隆吧!
我构建的一个载体,都从新做过好几次了
开花可要欣赏,然后就去远行;唯有不等花开,才能记得花红。
7楼2011-06-18 15:23:56
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匿名

用户注销 (小有名气)

本帖仅楼主可见
8楼2011-06-18 16:48:59
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啮风

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 欢迎应助 2011-06-19 12:19:49
克隆出现点突变很正常的啊,如果是做表达,只要你翻译的蛋白序列正确就OK了,毕竟很多氨基酸有多个密码子,核苷酸序列又不一定要100%相同。
9楼2011-06-18 23:57:17
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 好方法。不过overlaping PCR不容易上手。 2011-06-22 16:30:17
做了几次构建,都有相同的突变
那大概就是模板突变了
很简单的处理方法,分两段PCR,用引物修正突变位置,最后overlap在一起。
直接把质粒P下来的点突变方法也OK,不需要买试剂盒,多看看相关文献和经验就行
10楼2011-06-21 11:46:17
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