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78bio

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 厉害厉害! 2011-06-22 16:30:42
可以用点突变试剂盒,或重新做,
用高保真酶加热启动DNTP或者热启动引物我做100多个克隆没出现过突变,你可以试试
11楼2011-06-21 23:09:23
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zboter

银虫 (正式写手)

建议重新克隆,PCR使用保真酶
12楼2011-06-22 21:03:42
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amilie030312

金虫 (正式写手)

★ ★
西瓜(金币+2): 是的 2011-06-23 14:48:06
直接找高保真酶PCR就可以了,不过要注意真正的高保真PCR酶末端是完全没有A的,必须要做一步3‘加A的步骤才能克隆到T载体里,如果哪家忽悠他们的酶是高保真酶还能直接克隆到T载体里那这款酶要么根本就不是高保真酶,要么是高保真酶和Taq的混合酶,理解了原理就不会那么容易被忽悠了。
13楼2011-06-23 10:12:59
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zhcosa

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-23 14:48:18
还是重新克隆比较便宜快捷吧!
这个突变有没有引起氨基酸变化呢?对分子构象和功能影响很大么?说不定就是不同个体间一级结构的微小差异,SNP之类的也说不定。要是没什么影响就不要太顾虑了吧……祝你好运
14楼2011-06-23 10:50:46
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
如果你只测了一个克隆有突变的话那就多送测几个,看有没有序列正确的。如果是送测的全是在那个位置有突变可以做定点修复
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
15楼2011-06-26 21:48:58
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sfb1020

金虫 (小有名气)

我也出现过这种问题,老有点突变,就是测序时多测几个,总有一个是正确的
16楼2011-06-27 10:17:54
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chenyanzhen

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 天使托 at 2011-06-17 21:59:40
1:首先看楼主是做什么用了,做什么用很关键的,你如果想表达蛋白,那么重新克隆吧。。。如果是做敲除,构建重组载体,那大可不必。

2:其实见第一条,已经说了,目的不同,操作不同,思路也不同;

3:祝好运!

如果是用来做阳性对照呢,有影响吗?
活在当下,充实自己
17楼2014-06-12 17:30:55
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