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zld629

木虫 (小有名气)

[求助] 平末端连接,连上了,很多转化子中没有一个正确的,怎么办?

在构建一个载体到了最后一步平末端连接,总是不成功。转化后长了不少菌,挑了100多那个,几乎整板都挑了,没有一个对的。怎么办?我用载体上片段做正引物、插入片段末端做反引物,做PCR,连接液有很亮的带,应该是有连上的了,为什么转化子中却没有?如何解决这个问题呢?
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zld629

木虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 陈帅印 at 2012-06-25 11:25:27
先加A连接到t载体上,鉴定后酶切,再连接到目的载体上。实在不行试试In-Fusion克隆技术。http://wenku.baidu.com/view/5bb2f4a70029bd64783e2c60.html?st=1

才发现以前的引物设计有问题,没有包括酶切位点的另一边。
9楼2012-06-26 08:38:19
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查看全部 14 个回答

zld629

木虫 (小有名气)

补充一下:我的载体是用PMEI酶切的,片段是用高保真PCR的;也试过连接液中加入PMEI,长了7个菌,以为是的了,结果一PCR验证,还不是。都做了两个月了,崩溃中
2楼2012-06-24 19:40:10
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chen.qiqi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助,很热心哦 2012-06-25 13:44:46
有可能是把载体转化进去的那一步操作不好,温度时间没有控制好。
也有可能选的菌比较难转化成功,毕竟转化的成功率一般都低。
你可以这么试试,结合载体的类型和大小,选用另外一种公认容易转化成功的菌,试试能不能转进去。如果能转进去,说明你之前的菌较难转化。如果不能转进去,说明载体其实没有链接好或者操作过程有问题。
3楼2012-06-25 00:25:52
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陈帅印

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-25 13:44:56
先加A连接到t载体上,鉴定后酶切,再连接到目的载体上。实在不行试试In-Fusion克隆技术。http://wenku.baidu.com/view/5bb2f4a70029bd64783e2c60.html?st=1
4楼2012-06-25 11:25:27
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