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yesucao

木虫 (正式写手)

[求助] 连接后转化子PCR出现非特异性的条带

实验主要内容：
1、将目的基因和已经连有启动子的载体连接，挑单菌落PCR验证是否含有目的条带
2、挑取能 P 出条带的单菌落，摇菌，保藏，提质粒
3、用提取的质粒，再次PCR验证是否含有启动子基因
问题：
PCR验证是否含有启动子的时候，跑胶结果显示：除了自己的启动子条带，还出现2条非特异性的条带，但是阳性对照只有一条，之前一直是用这个体系，出现这样的问题，很怕是自己摇菌的过程中出现污染所致。
还请各位帮忙分析一下。 目前本人已经在做质粒的单双酶切验证，结果没出来。
如图  左一：阳性对照（启动子条带1000bp多一点）
      右一：Marker（4500、3000、2000、1200、800、500、200）
          其他全部是质粒PCR（每个做了两个平行，一共7个）
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1楼 2011-08-31 19:37:12
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

yesucao(金币+3): 有这个考虑 2011-09-01 10:45:35
yesucao(金币+3): 散币了，酶切结果出来了，实验失败，继续努力 2011-09-01 15:53:03
如果能测序的话，建议楼主最好测序可确定到底连入的是不是自己想要的片段！
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jiayoubashaonian
2楼2011-08-31 19:46:49
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yesucao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-31 19:46:49:
如果能测序的话，建议楼主最好测序可确定到底连入的是不是自己想要的片段！

PCR，割胶回收，T载体连接，然后送去测序吗？？还是可以直接送去测序呢？？？
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3楼2011-08-31 19:49:35
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

yesucao(金币+1): 2011-09-01 10:45:46
yesucao(金币+3): 散币了，酶切结果出来了，实验失败，继续努力 2011-09-01 15:53:51
引用回帖:
3楼: Originally posted by yesucao at 2011-08-31 19:49:35:
PCR，割胶回收，T载体连接，然后送去测序吗？？还是可以直接送去测序呢？？？

楼主有引物的话，可以直接送质粒测序，今天送明天出，可以看一下到底是哪里出了问题！当然质粒浓度别太小，可问一下技术！
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jiayoubashaonian
4楼2011-08-31 19:51:34
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yesucao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-31 19:46:49:
如果能测序的话，建议楼主最好测序可确定到底连入的是不是自己想要的片段！

这次PCR是我之前已经确定启动子连接上去了的，现在是将目的基因连接上去，因是单酶切插入的，所以保险起见的话还是把启动子也P了一下
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5楼2011-08-31 19:53:41
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yesucao(金币+2): 酶切正在做，目前在思考怎么判断目的片段的正反，有测序的打算 2011-09-01 10:47:26
yesucao(金币+3): 散币了，酶切结果出来了，实验失败，继续努力 2011-09-01 15:53:23
有没有可能你目的片段连接上去的位置反了？你有没有验证的，最好是酶切验证，再是PCR验证，再TA克隆下测个序。
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6楼2011-08-31 19:59:26
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-08-31 20:05:45
yesucao(金币+2): 希望奇迹能出现 2011-09-01 10:51:28
yesucao(金币+3): 散币了，酶切结果出来了，实验失败，继续努力 2011-09-01 15:53:36
引用回帖:
5楼: Originally posted by yesucao at 2011-08-31 19:53:41:
这次PCR是我之前已经确定启动子连接上去了的，现在是将目的基因连接上去，因是单酶切插入的，所以保险起见的话还是把启动子也P了一下

楼主的退火温度是多少?有没有可能是非特异性扩增，我们在以前实验碰到这样的情况：构建的互补载体，要扩增的目的带是1.3k左右，担心扩不出来，延伸时间设成2min，结果出来了2k多的片段，但测序后发现连入的片段居然是正确的，但是就没再找其他原因。
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jiayoubashaonian
7楼2011-08-31 20:00:53
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yesucao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-31 20:00:53:
楼主的退火温度是多少?有没有可能是非特异性扩增，我们在以前实验碰到这样的情况：构建的互补载体，要扩增的目的带是1.3k左右，担心扩不出来，延伸时间设成2min，结果出来了2k多的片段，但测序后发现连入的片段居 ...

连接前后启动子的扩增体系没有变，有待进一步测序才能知晓答案
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8楼2011-09-01 10:50:22
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
9楼2011-09-01 15:54:08
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hzxm0316

铁虫 (初入文坛)
同样转化后挑斑电泳，出现了非特异性条带，求解中？？？
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10楼2012-06-25 21:52:35
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