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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接后转化子PCR出现非特异性的条带
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yesucao

木虫 (正式写手)

[求助] 连接后转化子PCR出现非特异性的条带

实验主要内容：
1、将目的基因和已经连有启动子的载体连接，挑单菌落PCR验证是否含有目的条带
2、挑取能 P 出条带的单菌落，摇菌，保藏，提质粒
3、用提取的质粒，再次PCR验证是否含有启动子基因
问题：
PCR验证是否含有启动子的时候，跑胶结果显示：除了自己的启动子条带，还出现2条非特异性的条带，但是阳性对照只有一条，之前一直是用这个体系，出现这样的问题，很怕是自己摇菌的过程中出现污染所致。
还请各位帮忙分析一下。 目前本人已经在做质粒的单双酶切验证，结果没出来。
如图  左一：阳性对照（启动子条带1000bp多一点）
      右一：Marker（4500、3000、2000、1200、800、500、200）
          其他全部是质粒PCR（每个做了两个平行，一共7个）
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1楼 2011-08-31 19:37:12
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yesucao(金币+2): 酶切正在做，目前在思考怎么判断目的片段的正反，有测序的打算 2011-09-01 10:47:26
yesucao(金币+3): 散币了，酶切结果出来了，实验失败，继续努力 2011-09-01 15:53:23
有没有可能你目的片段连接上去的位置反了？你有没有验证的，最好是酶切验证，再是PCR验证，再TA克隆下测个序。
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6楼2011-08-31 19:59:26
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

yesucao(金币+3): 有这个考虑 2011-09-01 10:45:35
yesucao(金币+3): 散币了，酶切结果出来了，实验失败，继续努力 2011-09-01 15:53:03
如果能测序的话，建议楼主最好测序可确定到底连入的是不是自己想要的片段！
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jiayoubashaonian
2楼2011-08-31 19:46:49
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yesucao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-31 19:46:49:
如果能测序的话，建议楼主最好测序可确定到底连入的是不是自己想要的片段！

PCR，割胶回收，T载体连接，然后送去测序吗？？还是可以直接送去测序呢？？？
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3楼2011-08-31 19:49:35
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

yesucao(金币+1): 2011-09-01 10:45:46
yesucao(金币+3): 散币了，酶切结果出来了，实验失败，继续努力 2011-09-01 15:53:51
引用回帖:
3楼: Originally posted by yesucao at 2011-08-31 19:49:35:
PCR，割胶回收，T载体连接，然后送去测序吗？？还是可以直接送去测序呢？？？

楼主有引物的话，可以直接送质粒测序，今天送明天出，可以看一下到底是哪里出了问题！当然质粒浓度别太小，可问一下技术！
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jiayoubashaonian
4楼2011-08-31 19:51:34
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