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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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devil2006

木虫 (正式写手)

[求助] 质粒构建时连接的片段总是反方向,求助!

质粒构建时连接的片段总是反方向,验证10个已连接上目的片段的转化子,都是反向连接,请问各位虫友遇到过这种问题么?有没有好的解决方法呢,谢谢!
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

★ ★
devil2006(金币+2): 我的下一步也是连接片段,可是这第一个片段方向反了,不能继续进行,我再多连几次吧,谢谢你 2011-08-27 17:41:15
dhd997(金币+2): good 2011-08-28 07:51:17
遇到过,而且我也做过很多次,我觉得片段连接到质粒上有一定的方向偏好性,最后我是加的酶切位点,以连接上目的片段的质粒为模板重新p的,因为我的下一步还是片段连接。我不知道你一步用来干什么,但是必须要反向的话很难的,但正向的几率也还是有的,主要靠运气吧,我同学有不断连接。。。得到的。
生命即这般无尽变数,辗转来去皆苛求不得
2楼2011-08-27 15:24:22
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
1楼: Originally posted by devil2006 at 2011-08-27 13:27:30:
质粒构建时连接的片段总是反方向,验证10个已连接上目的片段的转化子,都是反向连接,请问各位虫友遇到过这种问题么?有没有好的解决方法呢,谢谢!

楼主不是通过酶切位点连的,还是简单的TA克隆?
jiayoubashaonian
3楼2011-08-27 15:37:20
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

devil2006(金币+2): 我就是通过去磷酸化酶处理载体,然后连接的片段,请问如何能控制连接方向?谢谢啦 2011-08-27 17:44:40
用去磷酸化酶处理载体和DNA片段,可以控制连接方向
一直向前!
4楼2011-08-27 17:13:54
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devil2006

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 15:37:20:
楼主不是通过酶切位点连的,还是简单的TA克隆?

我是载体和片段单酶切,然后连接的,可是总是反向
5楼2011-08-27 17:42:41
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by devil2006 at 2011-08-27 17:42:41:
我是载体和片段单酶切,然后连接的,可是总是反向

原来是这样,这个楼主可能要碰运气了吧!能不能再看一下,看能不能有双酶切位点!
jiayoubashaonian
6楼2011-08-27 17:47:32
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 可以试试 2011-08-27 21:14:57
dhd997(MolEPI+1): 追加 2011-08-28 07:51:59
devil2006(金币+6): 谢谢,我就是用个载体上的引物和基因的一个引物验证的,结果都是反向,是不是与载体和片段的结构有关啊? 2011-08-28 08:41:18
正方几率都应该有的,还是筛选上下功夫吧。建议你做菌落PCR验证的时候不用要扩增基因的那对引物,用一个载体上的引物和基因的一个引物,这样能直接筛选出你要的正向连接的克隆。
7楼2011-08-27 19:17:27
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roomofxw

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-08-27 19:17:27:
正方几率都应该有的,还是筛选上下功夫吧。建议你做菌落PCR验证的时候不用要扩增基因的那对引物,用一个载体上的引物和基因的一个引物,这样能直接筛选出你要的正向连接的克隆。

正解呀
8楼2011-08-27 23:51:21
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