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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建时连接的片段总是反方向，求助！
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devil2006

木虫 (正式写手)

[求助] 质粒构建时连接的片段总是反方向，求助！

质粒构建时连接的片段总是反方向，验证10个已连接上目的片段的转化子，都是反向连接，请问各位虫友遇到过这种问题么？有没有好的解决方法呢，谢谢！
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1楼 2011-08-27 13:27:30
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

★ ★
devil2006(金币+2): 我的下一步也是连接片段，可是这第一个片段方向反了，不能继续进行，我再多连几次吧，谢谢你 2011-08-27 17:41:15
dhd997(金币+2): good 2011-08-28 07:51:17
遇到过，而且我也做过很多次，我觉得片段连接到质粒上有一定的方向偏好性，最后我是加的酶切位点，以连接上目的片段的质粒为模板重新p的，因为我的下一步还是片段连接。我不知道你一步用来干什么，但是必须要反向的话很难的，但正向的几率也还是有的，主要靠运气吧，我同学有不断连接。。。得到的。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
2楼2011-08-27 15:24:22
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
1楼: Originally posted by devil2006 at 2011-08-27 13:27:30:
质粒构建时连接的片段总是反方向，验证10个已连接上目的片段的转化子，都是反向连接，请问各位虫友遇到过这种问题么？有没有好的解决方法呢，谢谢！

楼主不是通过酶切位点连的，还是简单的TA克隆？
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jiayoubashaonian
3楼2011-08-27 15:37:20
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

devil2006(金币+2): 我就是通过去磷酸化酶处理载体，然后连接的片段，请问如何能控制连接方向？谢谢啦 2011-08-27 17:44:40
用去磷酸化酶处理载体和DNA片段，可以控制连接方向
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一直向前！
4楼2011-08-27 17:13:54
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devil2006

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 15:37:20:
楼主不是通过酶切位点连的，还是简单的TA克隆？

我是载体和片段单酶切，然后连接的，可是总是反向
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5楼2011-08-27 17:42:41
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by devil2006 at 2011-08-27 17:42:41:
我是载体和片段单酶切，然后连接的，可是总是反向

原来是这样，这个楼主可能要碰运气了吧！能不能再看一下，看能不能有双酶切位点！
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jiayoubashaonian
6楼2011-08-27 17:47:32
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 可以试试 2011-08-27 21:14:57
dhd997(MolEPI+1): 追加 2011-08-28 07:51:59
devil2006(金币+6): 谢谢，我就是用个载体上的引物和基因的一个引物验证的，结果都是反向，是不是与载体和片段的结构有关啊？ 2011-08-28 08:41:18
正方几率都应该有的，还是筛选上下功夫吧。建议你做菌落PCR验证的时候不用要扩增基因的那对引物，用一个载体上的引物和基因的一个引物，这样能直接筛选出你要的正向连接的克隆。
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7楼2011-08-27 19:17:27
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roomofxw

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-08-27 19:17:27:
正方几率都应该有的，还是筛选上下功夫吧。建议你做菌落PCR验证的时候不用要扩增基因的那对引物，用一个载体上的引物和基因的一个引物，这样能直接筛选出你要的正向连接的克隆。

正解呀
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8楼2011-08-27 23:51:21
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