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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~

[求助] 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建

如题，基因片段3.7Kb载体7Kb，Phage载体。
连接了几次都失败了。要么转化后没有长出克隆，要么长出来也是假阳性，小提质粒后酶切片段大小不对额
大片段不好连呢，求高手指教有妙招改进么？？
(转化采用的超级感受态细胞，42度30s)
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
1楼 2011-11-17 14:21:26
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longrna

新虫 (正式写手)
贴上你的连接体系及条件嘛，用哪家公司的酶？
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伟大航线....
2楼2011-11-17 18:06:25
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longrna

新虫 (正式写手)
我们一般4度过夜连接，用NEB的酶
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伟大航线....
3楼2011-11-17 18:10:05
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
2楼: Originally posted by longrna at 2011-11-17 18:06:25:
贴上你的连接体系及条件嘛，用哪家公司的酶？

takara的连接酶，16度过夜的
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
4楼2011-11-17 18:34:36
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longrna

新虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-11-17 21:37:34
Takara的酶不是很清楚，我们用NEB的话，一般16度一个小时或4度过夜（效率差不多）。
把载体及连接片段的比例再调整调整，我觉得只是效率问题，不可能一点都连不上的，除非连接酶有问题。
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伟大航线....
5楼2011-11-17 19:42:01
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2011-11-17 19:42:01:
Takara的酶不是很清楚，我们用NEB的话，一般16度一个小时或4度过夜（效率差不多）。
把载体及连接片段的比例再调整调整，我觉得只是效率问题，不可能一点都连不上的，除非连接酶有问题。

嗯，偶尔会长出几个克隆但酶切验证的片段大小总是只有2.几kb
还在继续摸索中呢
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6楼2011-11-17 20:09:46
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2011-11-17 19:42:01:
Takara的酶不是很清楚，我们用NEB的话，一般16度一个小时或4度过夜（效率差不多）。
把载体及连接片段的比例再调整调整，我觉得只是效率问题，不可能一点都连不上的，除非连接酶有问题。

你要点击应助回帖，我才可以发放金币哦
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7楼2011-11-17 20:10:57
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
林夕梦(金币+5): 听你这么说，顿时又有了信心。不过细节的应该没啥问题的，下次在调节一下连接体系吧 2011-11-17 20:56:54
西瓜(金币+2): Good！ 2011-11-17 21:37:58
wanhscn(金币+2, MolEPI+1): 是的!鼓励应助回帖!PS:我也连过10K的,没有那么难!希望老兄继续踊跃回帖! 破格授予专家指数一枚 ! 2011-11-19 18:53:58
这个片段3.7Kb，载体7Kb连接应该是很好连接地，我们超过10kb的连接经常做也没有多大的问题，只是连接效率比小片段低一些。
至于连接要注意实验中的一些小细节问题：酶切割胶回收纯化是否干净？连接体系比例合不合适？感受态细胞好不好？等等啦！
Takara的酶和NEB的酶都很好用的！祝实验顺利！
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8楼2011-11-17 20:31:40
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冉冉猫

新虫 (初入文坛)
我也一直构建失败~~~求指导
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林夕梦
9楼2011-11-17 21:01:07
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 冉冉猫 at 2011-11-17 21:01:07:
我也一直构建失败~~~求指导

加油
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10楼2011-11-17 21:07:48
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