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质粒载体构建的问题！
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由于实验之前做化学合成的比较多，最近老板让我转向生物，因此没有什么基础，也没有什么人可以求教，现在在构建载体时遇到一个问题，又苦于无人可问，只好到万能的丁香园了！ 是这样的，我的质粒是用hindIII单酶切的，插入的片段也都有HindIII的粘性末端，按道理说直接T4连接酶直接连接可以了，但是可能会产生很多自连，这个我都能理解；问题是资料上说对单酶切后的质粒做碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后的5'的磷酸基，就可以杜绝自连现象了。 我的疑惑是：单酶切后线性化质粒的5‘的磷酸基团在和插入片段连接是也是需要的呀，如果5'端磷酸基被去掉的话，插入片段DNA的3’的羟基与质粒的5‘怎么发生酯化反应呀？最后连接的产物不还是一个线性质粒吗? |
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