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zhuyanliang

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒载体构建的问题!

由于实验之前做化学合成的比较多,最近老板让我转向生物,因此没有什么基础,也没有什么人可以求教,现在在构建载体时遇到一个问题,又苦于无人可问,只好到万能的丁香园了!

是这样的,我的质粒是用hindIII单酶切的,插入的片段也都有HindIII的粘性末端,按道理说直接T4连接酶直接连接可以了,但是可能会产生很多自连,这个我都能理解;问题是资料上说对单酶切后的质粒做碱性磷酸酶(CIP)处理,去掉酶切后的5'的磷酸基,就可以杜绝自连现象了。
我的疑惑是:单酶切后线性化质粒的5‘的磷酸基团在和插入片段连接是也是需要的呀,如果5'端磷酸基被去掉的话,插入片段DNA的3’的羟基与质粒的5‘怎么发生酯化反应呀?最后连接的产物不还是一个线性质粒吗?
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

话说这里是万能的小木虫
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2013-06-06 20:58:51
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

★ ★
zhuyanliang(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-06-07 01:49:42
载体上的磷酸基团是去掉了,但是插入片段上面还有磷酸基团,还是可以连接的。
下次最好用两种不同的酶做双酶切吧,首先自连问题会小很多;其次,单酶切还有个插入方向的问题(因为两端切口是一样的,所以正向方向都可以连接),后续还要鉴定插入方向,费事些。
3楼2013-06-06 21:11:57
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

更正下,上面“所以正向方向都可以连接”应该是“所以正向反向都可以连接”……
4楼2013-06-06 21:13:38
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zhuyanliang

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 西瓜 at 2013-06-06 21:13:38
更正下,上面“所以正向方向都可以连接”应该是“所以正向反向都可以连接”……

感谢解答,但是我还有问题
你说插入片段上面有磷酸基团,难道是插入片段的3'端也有磷酸基团吗?不是一般3‘端都是羟基吗?
5楼2013-06-06 21:23:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhuyanliang at 2013-06-06 21:23:28
感谢解答,但是我还有问题
你说插入片段上面有磷酸基团,难道是插入片段的3'端也有磷酸基团吗?不是一般3‘端都是羟基吗?...

插入片段的5'P与载体分子的3’OH可以相连的。你要记住DNA是双链的,对每条链来说都有5'和3'端。所以连接后的产物还是成环的,只是两个nick。
6楼2013-06-07 00:38:50
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