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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建质粒时 质粒上的ATG与目的基因ATG 的问题
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Diacetyl

铁虫 (初入文坛)

[求助] 构建质粒时 质粒上的ATG与目的基因ATG 的问题

不知道各位在构建质粒时，遇到这种情况：
Nco I 位点处含有ATG密码子时，使用的酶切位点为 B、C两处，目的基因正向引物序列ACTCGAATCCATGGCAAGTTCG。
在氨基酸序列翻译时，是从A处的ATG开始，而B处的ATG阅读框发生改变？
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1楼 2012-04-26 14:31:03
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回帖置顶 ( 共有1个 )

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！ 2012-04-26 22:06:12
Diacetyl: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-04-27 13:43:56
有这么几个问题，
1，EcoRI 酶切位点是GAATTC,不是GAATCC，估计是手误。记得不要犯这种错误哦，不然引物合成出来，载体构建不成功都还知道是什么原因。
2，翻译是从载体上ATG开始的，即是你标记的A处，所以你的引物设计应该在酶切位点后面加一个G，即GAATTC-G，这样才能保证你的基因不移码。
3，既然翻译从载体上的ATG开始的，所以酶切位点后面可以不用再加你基因的ATG了。
4，EcoRI 酶切位点的保护碱基是CCG，当然也有人说可以随便加碱基，但个人认为竟然有保护碱基表，还是按照标准来。
所以引物应该是：CCG-GAATTC-G-GCAAGTTCG（后面再补几个碱基吧，至少18个碱基配对啊，才9个，太抠了吧）
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Thank-you，so-blue.
3楼2012-04-26 20:27:19
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普通回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核, 辛苦 2012-04-26 22:05:56
从A框也就是NcoI中的ATG开始翻译。
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2楼2012-04-26 20:20:45
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Diacetyl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2012-04-26 20:27:19:
有这么几个问题，
1，EcoRI 酶切位点是GAATTC,不是GAATCC，估计是手误。记得不要犯这种错误哦，不然引物合成出来，载体构建不成功都还知道是什么原因。
2，翻译是从载体上ATG开始的，即是你标记的A处，所以你的 ...

非常感谢给予的指正，现在明白怎样处理这样的问题了。
您第三点提到的 ATG是不是 可加可不加？
谢谢！
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4楼2012-04-27 13:43:19
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
引用回帖:
4楼: Originally posted by Diacetyl at 2012-04-27 13:43:19:
非常感谢给予的指正，现在明白怎样处理这样的问题了。
您第三点提到的 ATG是不是 可加可不加？
谢谢！

是的，可加可不加。
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Thank-you，so-blue.
5楼2012-04-27 21:02:10
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