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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新提的质粒DNA，关于浓度和纯度虫友们发表一些看法吧
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lihengyang86

铜虫 (小有名气)

[交流] 新提的质粒DNA，关于浓度和纯度虫友们发表一些看法吧

质粒名称        浓度（ng/μL）    A260/280                 A260/230
质粒1                       24                        1.97                           1.17
质粒2                       47.4                     1.93                           1.56
质粒3                       41.8                     1.98                           1.50


以上是今天提取的质粒的相关测定指标，请大家据此数据帮忙分析一下！个人感觉数值很不理想！提取的很不成功！
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1楼 2012-01-07 23:45:28
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回帖置顶 ( 共有2个 )

longrna

新虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！辛苦！ 2012-01-08 16:58:17
lihengyang86(金币+3): PET42a大小为5930bp，插入片段也就680bp左右。属不属于严紧型质粒倒不是很清楚。多谢您的关注和建议。 2012-01-08 18:15:05
4ml 菌只拿到了不到4ug的质粒～
PET42a  6k? 插入片段多大？整个质粒多大？属于低拷贝不？
如果属于低拷贝，这个产量也说得过去。

有两种思路：
1）你用同样的操作及kit 提一个正常（高拷贝的质粒）的菌液，看产量是否有问题，如没问题则说明你的菌“有问题”（：本身质粒的拷贝数低问题）
2）如果是本身菌质粒拷贝数低的问题，则另想解决办法：如优化摇菌时间，用营养丰富的培养基，培养提取时的菌液用量或直接中提等等。
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13楼2012-01-08 16:18:36
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lihengyang86(金币+2): 学习了！多谢！ 2012-01-11 19:39:22
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good！ 2012-01-13 11:43:24
小体系（20ml以下）里是没有关系的，大系A600高了就不行了，这主要与溶氧和营养有关；比如说3ml的体系，比表面积足够大，对LB的营养来说A600达到最大也能满足溶氧需求，但是对于200ml的体系情况就大不一样，即要保证营养，又要保证溶氧，DNA的合成需要消耗大里的能量，质粒扩增也需要压力，上面所有原因的集合，就是前面摸出来的条件，不同的质粒会略有不同，但是不会超出这个范围
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20楼2012-01-11 18:00:30
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
29楼: Originally posted by dongniaoxin at 2012-04-11 13:16:36:
我是个新手，想问一下质粒的大提和小提应用范围有何不同，还有影响质粒大提所得质粒浓度的具体因素都有哪些，谢谢

应用范围来说，主要看你的需要了，如果你要20ug以下，小提的量就足够了，100ug以下，你可以小提多提几个，也很快的，如果不超过200ug或200ug左右，估计一个中提的量也够了，800ug以上，那只有大提了。另外也要看你所需要质粒的质量了，没有特殊要求，普通的试剂盒就可以，如果盐要少，那提的时候就要多洗两次，如果要去内毒素，就要用去内毒素的试剂盒。
影响大提所提质粒的量主要跟菌体培养、所用试剂盒和质粒提取的操方有关；菌体的用量是在试剂盒允许的范围内越多越好，当然了，高考贝质粒的话，可能用一半的菌体量所得的质粒就会超出柱子的承载能力，就没有必要培养那么多菌了；现在很多的试剂盒的说明书都不是最优的操作方法，完全可以大胆的改进
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30楼2012-04-12 09:46:35
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普通回帖

lixingliang

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
浓度怎么这么低呢，请问你的质粒是低拷贝的吗，是小抽，还是中抽，抑或大抽
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2楼2012-01-08 07:59:19
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lixingliang

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lihengyang86(金币+1): 摇菌10h，用了4mL菌液提的。 2012-01-08 10:52:22
西瓜(金币+1): 鼓励交流！ 2012-01-08 16:55:39
还有请问你摇菌多长时间啊，用多少毫升菌液抽得啊
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3楼2012-01-08 08:00:06
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lyd0311

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
手提还是试剂盒 用的什么公司的
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5楼2012-01-08 09:46:31
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lihengyang86

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lixingliang at 2012-01-08 07:59:19:
浓度怎么这么低呢，请问你的质粒是低拷贝的吗，是小抽，还是中抽，抑或大抽

哦！是啊！浓度低了！我提的是PET42a重组质粒，用的康为世纪的质粒小提试剂盒。
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7楼2012-01-08 10:50:58
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lihengyang86

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lyd0311 at 2012-01-08 09:46:31:
手提还是试剂盒 用的什么公司的

用的康为世纪质粒 小提试剂盒
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8楼2012-01-08 10:53:57
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vickie20

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
浓度很低，你看你的菌是不是摇过了
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9楼2012-01-08 11:23:36
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lihengyang86

铜虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+8): 2012-01-08 16:55:54
西瓜(金币-7): 误操作了，现在更正，实在抱歉啊~ 2012-01-09 17:52:05
引用回帖:
9楼: Originally posted by vickie20 at 2012-01-08 11:23:36:
浓度很低，你看你的菌是不是摇过了

是啊！我摇菌10h，你通常摇菌多长时间啊？谢谢！
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10楼2012-01-08 11:29:18
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longrna

新虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lihengyang86(金币+1): 说的有道理，我吸取了4mL菌液，最后回收了80μL，浓度分别如前所示。 2012-01-08 14:56:28
西瓜(金币+2): 赞成！ 2012-01-08 16:54:56
质粒提得浓度低原因有很多：
菌问题，养菌时间，拷贝数。
操作问题（可能性较小）
kit问题
等等

另外，你只列一个所得质粒浓度还不如直接说用多少菌液提，提得多少ug 质粒。
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11楼2012-01-08 13:24:08
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vickie20

铜虫 (小有名气)
我一般摇菌8小时
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12楼2012-01-08 14:22:27
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lihengyang86

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by longrna at 2012-01-08 16:18:36:
4ml 菌只拿到了不到4ug的质粒～
PET42a  6k? 插入片段多大？整个质粒多大？属于低拷贝不？
如果属于低拷贝，这个产量也说得过去。

有两种思路：
1）你用同样的操作及kit 提一个正常（高拷贝的质粒）的菌液 ...

我考虑可能是我用的是质粒小提试剂盒的原因吧！因为我们实验室几个人提的结果都是这个水平！用的一样的小提试剂盒。
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15楼2012-01-08 18:17:43
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lyd0311

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lihengyang86(金币+2): 哦！好的！多谢关注！ 2012-01-09 13:02:22
wanhscn(金币+1): i 2012-01-09 17:32:27
lihengyang86(金币+1): 多谢关注！ 2012-01-11 18:39:38
引用回帖:
8楼: Originally posted by lihengyang86 at 2012-01-08 10:53:57:
用的康为世纪质粒 小提试剂盒

有些试剂盒提出来就是浓度低
可以尝试手提一次
我曾经碰到过类似的问题
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16楼2012-01-09 10:27:23
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tiancailijia

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜: 直接百度即可 2012-01-09 17:52:51
你好，我是新手，想问下 A260/280与 A260/230的区别，质粒DNA在什么范围才算比较纯？
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17楼2012-01-09 16:56:39
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励交流。1.78,1.93，这么精确啊 2012-01-09 17:53:45
lihengyang86(金币+2): 那要是这样的话，我提的效率很低了 ！4mL菌液才提了不到4μg！请问你摇菌大概多长时间？！ 2012-01-10 14:49:12
康为的试剂盒还是不错的；对于低拷贝数很低的质粒，每ml菌液至少也能提个3到4ug质粒的，对于所提取质粒的质量，A260/A230的值在1.85左右是最好的，低于1.78高于1.93对细胞转化都会有影响，要是酶切或转化大肠的话，可能没有什么影响吧。质粒提取的关键在菌体的培养，一般培养到菌液A600在2.0左右为最好，高于2.5会影响质粒的拷贝数，低于1.5所收的菌量太少。
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18楼2012-01-09 17:36:13
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+1): 感谢积极交流哦 2012-01-11 08:19:16
lihengyang86(金币+2): 谢谢！我就是小提！另外，想请问为啥提质粒时，不是A值越高越好？！ 2012-01-11 16:19:18
因为我提的质粒没有超出这个范围的，转化细胞都很好，有同事提的超出了这个范围，出了些意外，但是不能确定是不是质粒的问题，但是没有找到其它原因，所以就都当是这个的原因了。

如果你是小提的话，单菌落接3ml的LB37度过液就没有问题的，如果你是中提或大提的话，种子长到A600 1.2左右，200ml/50ml培养基，接20ul，摇床180rpm，过夜，大概长到1.8左右吧，这样就可以了
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19楼2012-01-10 23:54:31
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lihengyang86

铜虫 (小有名气)
★
小丹木木(金币+1): 鼓励交流 2012-01-12 08:26:56
引用回帖:
17楼: Originally posted by tiancailijia at 2012-01-09 16:56:39:
你好，我是新手，想问下 A260/280与 A260/230的区别，质粒DNA在什么范围才算比较纯？

两者都是用来评估核酸样品纯度的！
     纯DNA的A260/280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染；
     纯DNA和 RNA的A260/230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染。
一般情况下认为A260/280在1.7-1.9之间表明质粒比较纯。
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21楼2012-01-11 18:38:35
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lder

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lihengyang86(金币+1): 谢谢！只是我感觉照你说的，浓度不会有很大变化的！除非用大提的试剂盒！ 2012-01-12 13:59:32
小丹木木(金币+1): 鼓励交流 2012-01-12 16:35:27
你抽提的质粒浓度太低，纯度也高。
要提高浓度，建议适当延长培养时间，提高接种量以提高菌体浓度。
要提高质粒纯度话：建议选择合适质粒抽提试剂盒，omega和axygen的试剂盒都是不错的选择。
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22楼2012-01-12 10:26:44
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
生工质粒小量抽提试剂盒
过夜摇菌的菌液4.5ml提取，质粒稀释100倍

忘记OD是多少了，计算出来浓度是14次方
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23楼2012-01-12 11:48:28
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lihengyang86

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by sxxuan at 2012-01-12 11:48:28:
生工质粒小量抽提试剂盒
过夜摇菌的菌液4.5ml提取，质粒稀释100倍

忘记OD是多少了，计算出来浓度是14次方

你好！我没大看懂您的意思！劳驾您解释一下！多谢！
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24楼2012-01-12 14:00:19
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
24楼: Originally posted by lihengyang86 at 2012-01-12 14:00:19:
你好！我没大看懂您的意思！劳驾您解释一下！多谢！

4.5ml过夜摇菌的菌体提取质粒，60ul 洗脱，稀释100倍后测OD260和280，换算后浓度是1*10的14次方copies/ml
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25楼2012-01-12 14:25:59
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sxxuan

金虫 (著名写手)
lihengyang86(金币+1): 多谢关注！ 2012-01-13 11:25:30
只是说我用这样的方法提出来到质粒浓度是这样而已
每次我用OD260和280两者的比值来判断纯度的时候都发现提取的质粒纯度不够哇
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26楼2012-01-12 14:27:36
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絮白雪

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lihengyang86(金币+1): 多谢关注！ 2012-01-13 11:25:05
浓度偏低，不过酶切可以检测到，回收的话，有点不合适
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27楼2012-01-12 15:46:26
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bxhe

新虫 (初入文坛)
lihengyang86(金币+5): 说来看看！交流一下！ 2012-01-13 11:24:31
我的也差不多
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28楼2012-01-13 10:49:56
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dongniaoxin

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
20楼: Originally posted by ganchao1776 at 2012-01-11 18:00:30:
小体系（20ml以下）里是没有关系的，大系A600高了就不行了，这主要与溶氧和营养有关；比如说3ml的体系，比表面积足够大，对LB的营养来说A600达到最大也能满足溶氧需求，但是对于200ml的体系情况就大不一样，即要保 ...

我是个新手，想问一下质粒的大提和小提应用范围有何不同，还有影响质粒大提所得质粒浓度的具体因素都有哪些，谢谢
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29楼2012-04-11 13:16:36
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lzmhust

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也出现一次这样的情况，在DH5α中提取pET28a质粒，1.5ml菌液提取出来的质粒浓度是30ng/ul，菌液摇过了，培养了将近30h，所以我觉得楼主可以考虑下是不是摇过了
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31楼2012-08-13 16:08:59
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weining1203

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
31楼: Originally posted by lzmhust at 2012-08-13 16:08:59
我也出现一次这样的情况，在DH5α中提取pET28a质粒，1.5ml菌液提取出来的质粒浓度是30ng/ul，菌液摇过了，培养了将近30h，所以我觉得楼主可以考虑下是不是摇过了

您好，请问一下，我也从大肠杆菌中提pET-28a质粒，5ml菌液质粒浓度也才50ng/ul,这样的话能不能进行双酶切，再胶回收啊？
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32楼2012-10-23 19:28:50
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912212842

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
盐离子浓度比较高
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33楼2014-09-28 11:00:32
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zhang73114楼
2012-01-08 09:45   回复  
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zhengjiuhan14楼
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