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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】构建质粒问题
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380218013

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】构建质粒问题 已有8人参与

小弟构质粒时，涂布AMP平板有菌落，摇菌10H后菌液PCR有目的，但是小抽的时候发现沉淀的菌很少，所以小抽的浓度很低。 很困惑 不知道原因。请大虾指教。
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好好生活，努力赚钱
1楼 2011-04-14 19:03:23
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新人小玥

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
载体可能是低拷贝吧，这样长的比较慢
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2楼2011-04-16 22:58:48
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): good 2011-04-19 08:26:28
建议楼主摇菌时间延长，我们用的Pet28a和MBP有时也遇到这样的问题，就过夜摇菌。
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jiayoubashaonian
3楼2011-04-17 15:33:25
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
传说适当提高抗生素水平，延长培养时间可以增加拷贝
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4楼2011-04-17 19:05:39
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+3): good 2011-04-19 08:26:47
是不是拷贝数太低了
可以延长培养时间，多收集几次菌体
然后用试剂盒里边的柱子，收集质粒
把几个管都过到一个柱子里边
然后洗脱
最近提过一个18kb的低拷贝的质粒，就这样做的，效果很好
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5楼2011-04-19 06:44:11
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-04-19 19:01:19
应该是低拷贝的质粒，建议你在正常摇菌10h后再添加阿拉伯糖或者氯霉素都可以一定程度的提高质粒的拷贝，不过使用浓度我忘了，你再查一查吧
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
6楼2011-04-19 09:00:37
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yanying198

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你这是实验中的小问题，纯化，重新接菌
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7楼2011-04-19 15:09:50
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-04-19 19:01:38
引用回帖:
Originally posted by 380218013 at 2011-04-14 19:03:23:
小弟构质粒时，涂布AMP平板有菌落，摇菌10H后菌液PCR有目的，但是小抽的时候发现沉淀的菌很少，所以小抽的浓度很低。 很困惑 不知道原因。请大虾指教。

怎么很多同学有这个问题呢。
在构建质粒的时候，一定要选择好质粒和宿主的关系。
知道为什么pet32a最好选用的是BL21，为什么不是TOP10，不是DH5a
为什么与表达有关的修饰氨基酸的质粒反而用Rosseta做宿主最好？

明白配套的商业化的这些知识后，就知道怎么考虑问题了。

第一，你这个求助，没有说明使用的什么质粒？是商业化的质粒，还是自己实验室自己够造的质粒。
第二，一般重组质粒都会遇见拷贝数问题。
所以会有人保守性的先用TOP10等扩增质粒。然后质粒转化到表达菌株中。
第三，含量很少，做PCR就够了，因为你要相信，指数增长是很吓人的，1ul的量就足以扩增出很多。

第四，GT116宿主会长菌长得很慢，但是比较不会染杂菌。故可以考虑延长时间培养等。

希望能帮到你！
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最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
8楼2011-04-19 16:32:20
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-04-19 19:01:50
10H时间有些短哦，我们会摇260rmp,16H，你试下。
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9楼2011-04-19 18:23:35
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