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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

[求助] 构建好的质粒如何防止丢失

好不容易构建好一个重组质粒,在大肠杆菌中也能表达,但出现一个问题质粒会不会随菌体的传代而丢失呢,因为想应用于工业发酵,质粒丢失就不能表达相应蛋白了,那么如何防止传代过程中质粒的丢失呢,望高手指点。谢谢!
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)

直接把质粒提出来,风干,直接保存质粒
12楼2012-06-07 13:48:03
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普通回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

不是有抗生素压力吗?质粒丢失了,菌就会死掉。
Thank-you,so-blue.
2楼2011-10-14 11:23:11
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by susizheng at 2011-10-14 11:23:11:
不是有抗生素压力吗?质粒丢失了,菌就会死掉。

转化菌传代过程中我就没有再加抗生素了  当时加抗生素是为了筛选目的菌落 现在已经得到了转化菌株  所以觉得就没必要加抗生素了
3楼2011-10-14 15:07:23
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助! 2011-10-14 17:59:08
引用回帖:
3楼: Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-10-14 15:07:23:
转化菌传代过程中我就没有再加抗生素了  当时加抗生素是为了筛选目的菌落 现在已经得到了转化菌株  所以觉得就没必要加抗生素了

不要觉得不加就不加啊,
肯定是要加的,不然质粒会丢失的。
Thank-you,so-blue.
4楼2011-10-14 15:52:06
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doublehelix

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


wanhscn(金币+1): 鼓励应助! 2011-10-14 17:59:17
引用回帖:
3楼: Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-10-14 15:07:23:
转化菌传代过程中我就没有再加抗生素了  当时加抗生素是为了筛选目的菌落 现在已经得到了转化菌株  所以觉得就没必要加抗生素了

不加容易丢失的!
5楼2011-10-14 15:54:52
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丑牛1973

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): good 2011-10-14 18:11:50
一定要加,不加容易长杂菌,转化菌株也没有竞争优势
6楼2011-10-14 16:25:38
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weipufenxi

禁言 (小有名气)


wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-10-14 17:59:32
本帖内容被屏蔽

7楼2011-10-14 16:43:29
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

暗夜懒猫(金币+2): 2011-10-17 08:09:08
1.不管加不加抗生素,传代次数多了质粒拷贝数都会减少,蛋白表达水平都会下降
2.保存质粒是最安全保险的方法,每次用时可以重新转化
3.由于感受态制做时每一个菌所处的生理周期不同,所以转化后各个菌的表达水平大致可分为5个水平层次
4.由于第三个原因,所以发酵用的种子最好要经过筛选
5.筛选出好的单菌落要尽快做成种子库
6.在做种子库时要尽量减少传代次数
8楼2011-10-16 14:07:38
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zhange1987

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2599832楼: Originally posted by ganchao1776 at 2011-10-16 14:07:38
1.不管加不加抗生素,传代次数多了质粒拷贝数都会减少,蛋白表达水平都会下降
2.保存质粒是最安全保险的方法,每次用时可以重新转化
3.由于感受态制做时每一个菌所处的生理周期不同,所以转化后各个菌的表达水平大 ...

请教 我最近做重组菌产酶实验 发现酶活越来越低 是不是可能质粒部分丢失了 实在是想不出其他原因 每次重复外界条件都一样 貌似就只有菌的问题了
你不会找到路除非你敢于迷路加油。。。
9楼2012-06-06 15:05:29
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
4594757楼: Originally posted by zhange1987 at 2012-06-06 15:05:29
请教 我最近做重组菌产酶实验 发现酶活越来越低 是不是可能质粒部分丢失了 实在是想不出其他原因 每次重复外界条件都一样 貌似就只有菌的问题了...

有这个可能,你可以重新转化一下,选10个单菌落,挑取表达最好的一个扩增后甘油保存,-80度可以保存8个月,用的时候拿一支做种子就行了

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10楼2012-06-06 15:31:35
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