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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒构建步骤，回答的好，还有几十金币追加！！！！
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sc_truth

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】质粒构建步骤，回答的好，还有几十金币追加！！！！

跪求S100A16-GST 质粒构建步骤，酶切位点EcoRⅠ和NheⅠ两个。各位虫友帮帮忙啊，老板急着要，实验室没人做这个....百感交集！！！！！

[ Last edited by rainwander on 2011-1-5 at 23:40 ]
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1楼 2011-01-05 13:43:02
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feng__

金虫 (著名写手)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-05 14:05:59
载体和片段都用那2个酶进行酶切，回收后连接，转化，挑克隆，鉴定，木了
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2楼2011-01-05 13:50:23
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feilr

木虫 (正式写手)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-05 14:06:03
sc_truth(金币+1):虽然没有解释清楚我想要的，但是还是非常感激！ 2011-01-05 16:06:44
推荐给你一个软件，说不定能够帮上你进行设计，NoeClone,你可以在网上搜索下载的，然后设计目的基因的引物，PCR目的基因，双酶切目的基因和载体，胶回收，连接片段，转化细胞，鉴定质粒，电泳初检测，测序目的片段，在做实验之前最好搞清楚连接或者酶切会出错不，比如移位，位点插反等等

[ Last edited by feilr on 2011-1-5 at 14:07 ]
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3楼2011-01-05 14:03:49
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
版主说不好用“跪求”
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4楼2011-01-05 15:07:12
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sc_truth

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by sc_truth at 2011-01-05 13:43:02:
跪求S100A16-GST 质粒构建步骤，酶切位点EcoRⅠ和NheⅠ两个。各位虫友帮帮忙啊，老板急着要，实验室没人做这个....百感交集！！！！！

谢谢指点，能否再请您给一份详细步骤。因为是新手，基本原理清楚，但是不会具体实验操作！不胜感激！！！
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5楼2011-01-05 16:03:09
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scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)
详细步骤你得看分子克隆、分子生物学实验指南之类的书。要自己摸索了。
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6楼2011-01-05 16:17:54
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DH5a

银虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2):鼓励交流！ 2011-01-05 20:27:30
用一个酶切完之后，溶液回收，再用另一个酶切，胶回收，目的片段也是用同样的方法，然后按载体片段与目的片段1:3，酶联。转化，找阳性克隆。送测序
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7楼2011-01-05 20:03:03
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
rainwander(金币+1):《分子克隆实验指南》可是大全啊~~~鼓励积极参与~~~ 2011-01-07 21:20:32
看看《分子克隆》吧，说的再详细也没上面详细呀！
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8楼2011-01-05 22:47:58
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sc_truth

银虫 (初入文坛)
★
silicare(金币+1):多看看文献，网友提供的步骤你敢用吗？ 2011-01-07 08:22:04
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-01-05 22:47:58:
看看《分子克隆》吧，说的再详细也没上面详细呀！

但是上面只讲了原理呀，没有具体步骤哦，我想找份步骤借鉴借鉴。各位如果有的话，发至邮箱sc_truth@126.com，必有重谢！！！
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9楼2011-01-07 00:12:16
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sc_truth

银虫 (初入文坛)
rainwander:不是的啊，《分子克隆实验指南》主要讲的是方法步骤啊~~~ 2011-01-07 21:20:08
引用回帖:
Originally posted by DH5a at 2011-01-05 20:03:03:
用一个酶切完之后，溶液回收，再用另一个酶切，胶回收，目的片段也是用同样的方法，然后按载体片段与目的片段1:3，酶联。转化，找阳性克隆。送测序

但是上面只讲了原理呀，没有具体步骤哦，我想找份步骤借鉴借鉴。各位如果有的话，发至邮箱sc_truth@126.com，必有重谢！！！
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10楼2011-01-07 00:12:32
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by sc_truth at 2011-01-07 00:12:16:




但是上面只讲了原理呀，没有具体步骤哦，我想找份步骤借鉴借鉴。各位如果有的话，发至邮箱sc_truth@126.com，必有重谢！！！

分子克隆上原理其实讲的少，主要是各个实验步骤了.
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11楼2011-01-07 07:51:05
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alexguo221

金虫 (初入文坛)
sc_truth(金币+2):大致过程清楚了。我拿到的质粒用的是EcoRⅠ和NheⅠ两个酶切位点，但是NheⅠ毕竟不常用，所以要重新PCR一次。但是我仅知道这多，请教一下，下面的步骤，大致要怎么设计呢？ 2011-01-07 15:44:16
载体和目的片段都用这两个酶，酶切。2h左右。然后跑一个low melt胶。割胶回收，取样做连接。室温放置几个小时。然后再转化。最后挑取菌落，培养，鉴定。
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12楼2011-01-07 12:56:24
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alexguo221

金虫 (初入文坛)
sc_truth(金币+6):非常感激，先学着，不懂的，再请教各位师兄师姐！感激不尽！ 2011-01-08 00:03:52
如果你觉得NheⅠ不常用的话，你也可以用点EcoRⅠ单酶切。
载体用EcoRⅠ单酶切后，在low melt上跑出，割胶回收。再用去磷酸化酶处理，防止自连。
然后你的pcr产物，跑出后，割胶回收，可以先直接与T载体（比如pcr2.1）相连。然后转到感受态里面，涂板。
挑取菌落，培养，做个小题质粒，用EcoRⅠ酶切，跑胶，割胶回收。这个过程就可以把目的基因切了下来，并且是EcoRⅠ粘性末端。
最后你就可以拿预先处理好的载体和切下来的基因做连接。转化，涂板。
用EcoRⅠ单酶切，相比你那个双酶切，劣势是，可能会出现假阳性。
不用菌落长的多的话肯定会有真的。一半一半。
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13楼2011-01-07 23:17:39
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陈曦晨曦晨曦14楼
2012-03-12 16:40   回复  
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