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[交流]
【求助/交流】质粒构建步骤，回答的好，还有几十金币追加！！！！
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跪求S100A16-GST 质粒构建步骤，酶切位点EcoRⅠ和NheⅠ两个。各位虫友帮帮忙啊，老板急着要，实验室没人做这个....百感交集！！！！！ [ Last edited by rainwander on 2011-1-5 at 23:40 ] |
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2楼2011-01-05 13:50:23
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rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-05 14:06:03
sc_truth(金币+1):虽然没有解释清楚我想要的，但是还是非常感激！ 2011-01-05 16:06:44
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-05 14:06:03
sc_truth(金币+1):虽然没有解释清楚我想要的，但是还是非常感激！ 2011-01-05 16:06:44
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推荐给你一个软件，说不定能够帮上你进行设计，NoeClone,你可以在网上搜索下载的，然后设计目的基因的引物，PCR目的基因，双酶切目的基因和载体，胶回收，连接片段，转化细胞，鉴定质粒，电泳初检测，测序目的片段，在做实验之前最好搞清楚连接或者酶切会出错不，比如移位，位点插反等等 [ Last edited by feilr on 2011-1-5 at 14:07 ] |
3楼2011-01-05 14:03:49
4楼2011-01-05 15:07:12
5楼2011-01-05 16:03:09
6楼2011-01-05 16:17:54
7楼2011-01-05 20:03:03
8楼2011-01-05 22:47:58
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silicare(金币+1):多看看文献，网友提供的步骤你敢用吗？ 2011-01-07 08:22:04
silicare(金币+1):多看看文献，网友提供的步骤你敢用吗？ 2011-01-07 08:22:04
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但是上面只讲了原理呀，没有具体步骤哦，我想找份步骤借鉴借鉴。各位如果有的话，发至邮箱sc_truth@126.com，必有重谢！！！ |
9楼2011-01-07 00:12:16
rainwander:不是的啊，《分子克隆实验指南》主要讲的是方法步骤啊~~~ 2011-01-07 21:20:08
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但是上面只讲了原理呀，没有具体步骤哦，我想找份步骤借鉴借鉴。各位如果有的话，发至邮箱sc_truth@126.com，必有重谢！！！ |
10楼2011-01-07 00:12:32
11楼2011-01-07 07:51:05
12楼2011-01-07 12:56:24
sc_truth(金币+6):非常感激，先学着，不懂的，再请教各位师兄师姐！感激不尽！ 2011-01-08 00:03:52
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如果你觉得NheⅠ不常用的话，你也可以用点EcoRⅠ单酶切。 载体用EcoRⅠ单酶切后，在low melt上跑出，割胶回收。再用去磷酸化酶处理，防止自连。 然后你的pcr产物，跑出后，割胶回收，可以先直接与T载体（比如pcr2.1）相连。然后转到感受态里面，涂板。 挑取菌落，培养，做个小题质粒，用EcoRⅠ酶切，跑胶，割胶回收。这个过程就可以把目的基因切了下来，并且是EcoRⅠ粘性末端。 最后你就可以拿预先处理好的载体和切下来的基因做连接。转化，涂板。 用EcoRⅠ单酶切，相比你那个双酶切，劣势是，可能会出现假阳性。 不用菌落长的多的话肯定会有真的。一半一半。 |
13楼2011-01-07 23:17:39
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陈曦晨曦晨曦14楼
2012-03-12 16:40
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