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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主

[求助] 做好的质粒如果用完了,用怎样的步骤繁殖新的,保证质粒的质量啊?

如题


构建好的EYFP质粒,需要看荧光,将其转入拟南芥原生质体里面做亚细胞定位时需要10µg以上的质粒,所以,总是需要很大量。

我将质粒转化到大肠杆菌里面,amp的板子隔夜培养。

一种是挑板子上几个克隆一起共同液体培养,然后纯化出质粒。

一种是挑板子上的单克隆,然后划到另个amp板子上培养数小时,取菌落液体培养
,然后纯化


这两种办法,那种更好啊,帮我分析原因,我很想知道更理论的东西

[ Last edited by 听雪看山 on 2011-6-8 at 21:49 ]
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
听雪看山(金币+5): 谢谢,那么还有没有更好的办法 2011-06-08 21:48:06
西瓜(金币+3): 我也感觉后一种没必要啊。本来就是单菌落,没必要再划板。 2011-06-08 22:37:35
一种是挑板子上几个克隆一起共同液体培养,然后纯化出质粒。

一种是挑板子上的单克隆,然后划到另个amp板子上培养数小时,取菌落液体培养
,然后纯化


两种方法后一种纯化度更高

但是如果你能保证你质粒的纯度,感受态的效率,转化的效率,前一种方法更直接,简单。后一种看似画蛇添足,
但是如果测序出了问题,信号太乱的话,必须选择后面一种纯化方法
2楼2011-06-08 21:28:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

听雪看山(金币+5): 谢谢,很好的答案。。。我会参考的。。。保存质粒真的很重要 2011-06-09 04:58:06
你是需要大量的菌来提质粒吧。可以这样,挑单克隆接种到5ml LB(with Amp)里过夜培养,第二天取1ml过夜培养物,接到50ml新鲜的LB(with Amp)里,再摇床培养8~10小时(看情况,差不多到对数期就ok了),之后就是提质粒了。大概就是这样,可以根据你的情况调整下。

这样的话,首先挑的是单克隆,比较纯,而且之后用的是新鲜的培养基,抗生素不会因为培养时间太长而失效。
3楼2011-06-08 22:44:25
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

上面说的算是比较常规的操作啦。
如果原来的平板有污染了,可以从干净的地方再挑单克隆,划到新的板上就ok了。
菌液的话用加甘油冻存起来,-20度或-80度都可以。纯化好的质粒在-20度和-80度也冻一份,万一菌丢了还可以再转化。这样就更万无一失了。
4楼2011-06-08 22:48:19
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丫头7976

铜虫 (正式写手)

请问有EYFP的质粒图谱吗 或者碱基序列 多谢了
5楼2011-07-22 20:45:58
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空谷幽风

金虫 (正式写手)


西瓜(金币+1): 专家很谨慎啊,呵呵 2011-07-23 17:01:39
西瓜的建议很好啊,不过为了确保质粒是稳定增殖的,最好能在前两批每批都测一次序,如果没什么问题以后就可以直接用这种方法来培养了
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
6楼2011-07-22 21:24:55
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