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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主

[求助] 做好的质粒如果用完了，用怎样的步骤繁殖新的，保证质粒的质量啊？

如题


构建好的EYFP质粒，需要看荧光，将其转入拟南芥原生质体里面做亚细胞定位时需要10µg以上的质粒，所以，总是需要很大量。

我将质粒转化到大肠杆菌里面，amp的板子隔夜培养。

一种是挑板子上几个克隆一起共同液体培养，然后纯化出质粒。

一种是挑板子上的单克隆，然后划到另个amp板子上培养数小时，取菌落液体培养
，然后纯化


这两种办法，那种更好啊，帮我分析原因，我很想知道更理论的东西

[ Last edited by 听雪看山 on 2011-6-8 at 21:49 ]
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开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。
1楼 2011-06-08 18:27:12
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丫头7976

铜虫 (正式写手)
请问有EYFP的质粒图谱吗 或者碱基序列 多谢了
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5楼2011-07-22 20:45:58
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查看全部 6 个回答

cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
听雪看山(金币+5): 谢谢，那么还有没有更好的办法 2011-06-08 21:48:06
西瓜(金币+3): 我也感觉后一种没必要啊。本来就是单菌落，没必要再划板。 2011-06-08 22:37:35
一种是挑板子上几个克隆一起共同液体培养，然后纯化出质粒。

一种是挑板子上的单克隆，然后划到另个amp板子上培养数小时，取菌落液体培养
，然后纯化


两种方法后一种纯化度更高

但是如果你能保证你质粒的纯度，感受态的效率，转化的效率，前一种方法更直接，简单。后一种看似画蛇添足，
但是如果测序出了问题，信号太乱的话，必须选择后面一种纯化方法
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2楼2011-06-08 21:28:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

听雪看山(金币+5): 谢谢，很好的答案。。。我会参考的。。。保存质粒真的很重要 2011-06-09 04:58:06
你是需要大量的菌来提质粒吧。可以这样，挑单克隆接种到5ml LB（with Amp）里过夜培养，第二天取1ml过夜培养物，接到50ml新鲜的LB（with Amp）里，再摇床培养8～10小时（看情况，差不多到对数期就ok了），之后就是提质粒了。大概就是这样，可以根据你的情况调整下。

这样的话，首先挑的是单克隆，比较纯，而且之后用的是新鲜的培养基，抗生素不会因为培养时间太长而失效。
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3楼2011-06-08 22:44:25
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
上面说的算是比较常规的操作啦。
如果原来的平板有污染了，可以从干净的地方再挑单克隆，划到新的板上就ok了。
菌液的话用加甘油冻存起来，-20度或-80度都可以。纯化好的质粒在-20度和-80度也冻一份，万一菌丢了还可以再转化。这样就更万无一失了。
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4楼2011-06-08 22:48:19
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