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huangqihong

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教质粒构建问题已有9人参与

我有一个6kb左右的片段要连到载体上,而载体的大小只有5kb多,最近我用片段与载体比例大约为1:2-1:3进行连接,但一直没有得到克隆,请问是不是这样的比例不行,我该用多少的比例进行连接?谢谢指教!
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)

★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-30 08:34:48
外源片段要多些,即便你的外源片段较载体大。你的比例好像反过来差不多。
如果还连不上,就采用把体系做的浓点,转化时多转点。
2楼2010-11-30 08:31:54
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littlehong

木虫 (初入文坛)

★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-30 08:35:07
连接的时候,比例应该是片段:质粒=5:1,或者更高才行
3楼2010-11-30 08:33:40
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)

穷鬼


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
这个有严格的比例限制吗?应该是构建好的质粒大小不要太大就ok了吧。
严于律己,宽以待人
4楼2010-11-30 09:24:13
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lyl19860712

金虫 (小有名气)


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质粒和片段比例应该是1:5到1:8,片段应该多些,片段和质粒都要纯。质粒和片段比例计算:质粒/片段(摩尔比例)=A,质粒/片段(分子质量)=B,质粒浓度/片段浓度(ng/ul)=C, 质粒/片段(体积)=x,则x=AB/C。
质粒和片段浓度可以根据MARKER大概估算,其实没那么精确,但也不能随便加
5楼2010-11-30 10:35:12
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)


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片段大小差不多。按载体:片段1:3做差不多。
6楼2010-11-30 12:14:15
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

因为两个长度差不多,所以连接比不用太离谱,1:1~1:3都可以
个人建议4度过夜连
7楼2010-11-30 12:48:43
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by lyl19860712 at 2010-11-30 10:35:12:
质粒和片段比例应该是1:5到1:8,片段应该多些,片段和质粒都要纯。质粒和片段比例计算:质粒/片段(摩尔比例)=A,质粒/片段(分子质量)=B,质粒浓度/片段浓度(ng/ul)=C, 质粒/片段(体积)=x,则x ...

两者的比例跟连接效率有关,如果做的次数和量够多的话,比例不是最关键的,酶切倒是影响很大。
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
8楼2010-11-30 13:35:04
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)


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如果感受态效率没有问题的话,连接的比例可以是片段比载体为2:1~1:1试试,确保片段和载体的浓度,祝试验顺利!
9楼2010-11-30 15:32:58
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
这个你得跑电泳看看你的片段和质粒的亮度,但是一般DNA是多一些,载体少一些!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
10楼2010-11-30 16:16:51
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