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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教质粒构建问题
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huangqihong

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教质粒构建问题 已有9人参与

我有一个6kb左右的片段要连到载体上，而载体的大小只有5kb多，最近我用片段与载体比例大约为1:2-1:3进行连接，但一直没有得到克隆，请问是不是这样的比例不行，我该用多少的比例进行连接？谢谢指教！
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1楼 2010-11-30 01:34:26
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-30 08:34:48
外源片段要多些，即便你的外源片段较载体大。你的比例好像反过来差不多。
如果还连不上，就采用把体系做的浓点，转化时多转点。
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2楼2010-11-30 08:31:54
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littlehong

木虫 (初入文坛)
★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-30 08:35:07
连接的时候，比例应该是片段：质粒=5：1，或者更高才行
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3楼2010-11-30 08:33:40
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)

穷鬼
★
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这个有严格的比例限制吗？应该是构建好的质粒大小不要太大就ok了吧。
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严于律己，宽以待人
4楼2010-11-30 09:24:13
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lyl19860712

金虫 (小有名气)
★
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质粒和片段比例应该是1:5到1：8，片段应该多些，片段和质粒都要纯。质粒和片段比例计算：质粒/片段（摩尔比例）=A，质粒/片段(分子质量)＝Ｂ，质粒浓度／片段浓度（ｎｇ／ｕｌ）＝Ｃ，　质粒/片段(体积)＝ｘ，则ｘ＝ＡＢ／Ｃ。
质粒和片段浓度可以根据ＭＡＲＫＥＲ大概估算，其实没那么精确，但也不能随便加
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5楼2010-11-30 10:35:12
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★
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片段大小差不多。按载体：片段1:3做差不多。
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6楼2010-11-30 12:14:15
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
因为两个长度差不多，所以连接比不用太离谱，1:1~1:3都可以
个人建议4度过夜连
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7楼2010-11-30 12:48:43
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lyl19860712 at 2010-11-30 10:35:12:
质粒和片段比例应该是1:5到1：8，片段应该多些，片段和质粒都要纯。质粒和片段比例计算：质粒/片段（摩尔比例）=A，质粒/片段(分子质量)＝Ｂ，质粒浓度／片段浓度（ｎｇ／ｕｌ）＝Ｃ，　质粒/片段(体积)＝ｘ，则ｘ ...

两者的比例跟连接效率有关，如果做的次数和量够多的话，比例不是最关键的，酶切倒是影响很大。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
8楼2010-11-30 13:35:04
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)
★
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如果感受态效率没有问题的话，连接的比例可以是片段比载体为2:1~1:1试试，确保片段和载体的浓度，祝试验顺利！
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9楼2010-11-30 15:32:58
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
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这个你得跑电泳看看你的片段和质粒的亮度，但是一般DNA是多一些，载体少一些！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
10楼2010-11-30 16:16:51
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