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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒载体构建的问题！
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zhuyanliang

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒载体构建的问题！

由于实验之前做化学合成的比较多，最近老板让我转向生物，因此没有什么基础，也没有什么人可以求教，现在在构建载体时遇到一个问题，又苦于无人可问，只好到万能的丁香园了！

是这样的，我的质粒是用hindIII单酶切的，插入的片段也都有HindIII的粘性末端，按道理说直接T4连接酶直接连接可以了，但是可能会产生很多自连，这个我都能理解；问题是资料上说对单酶切后的质粒做碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后的5'的磷酸基，就可以杜绝自连现象了。
我的疑惑是：单酶切后线性化质粒的5‘的磷酸基团在和插入片段连接是也是需要的呀，如果5'端磷酸基被去掉的话，插入片段DNA的3’的羟基与质粒的5‘怎么发生酯化反应呀？最后连接的产物不还是一个线性质粒吗?
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1楼 2013-06-06 20:36:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhuyanliang at 2013-06-06 21:23:28
感谢解答，但是我还有问题
你说插入片段上面有磷酸基团，难道是插入片段的3'端也有磷酸基团吗？不是一般3‘端都是羟基吗？...

插入片段的5'P与载体分子的3’OH可以相连的。你要记住DNA是双链的，对每条链来说都有5'和3'端。所以连接后的产物还是成环的，只是两个nick。
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6楼2013-06-07 00:38:50
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
话说这里是万能的小木虫
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2013-06-06 20:58:51
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
zhuyanliang(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-07 01:49:42
载体上的磷酸基团是去掉了，但是插入片段上面还有磷酸基团，还是可以连接的。
下次最好用两种不同的酶做双酶切吧，首先自连问题会小很多；其次，单酶切还有个插入方向的问题（因为两端切口是一样的，所以正向方向都可以连接），后续还要鉴定插入方向，费事些。
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3楼2013-06-06 21:11:57
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
更正下，上面“所以正向方向都可以连接”应该是“所以正向反向都可以连接”……
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4楼2013-06-06 21:13:38
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