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tzaixmc

木虫 (正式写手)

[求助] 细菌基因组文库构建的相关问题

目前想要用质粒pUCM-T建一个2-6kb的细菌基因组的质粒文库。实验室没人做过，啥也不懂，望高手出来解答一下。谢谢！
1.  质粒载体酶切后要先切胶回收，再用CIAP处理完后再用切胶回收吗？
2.  2-6kb的回收片段和末端磷酸化的载体连接时加入量多少比较合适？有人说按DNA载体和外源片断以6:1的摩尔比，那要分别加多少够做一次转化？
3.  如果我想建这个库要8000的克隆，那我如果一次转化只有500个怎么办？是多做累积到8000个还是一次多做几管连接转化累计到8000个克隆？
4. 对构建出来的文库我想用池的方式保存。我想要提取里面的质粒转化打另外一株菌中做活性检测，那这个质粒提取我是直接提取一个池的质粒，还是从这个池里接种一点到新的培养基中，培养起来再做转化？
望高手出来解答一下啊，非常感谢！
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1楼 2012-07-19 17:18:49
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回帖置顶 ( 共有1个 )

jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tzaixmc: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-07-20 14:13:50
rainwander: MicEPI+1, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:24
1.载体质粒你先切胶回收，之后CIAP，最后直接溶液回收就可以了。
2.关于连接体系，一般做10ul吧，黏性末端采用T4连接酶吧，我一般体现为：1ul 10Xbuffer，1ul 酶，0.5-1ul 载体，剩余的全加目的片段补足至10ul。10ul连接体系转化一管，你的转化效率有点低，我一般连接一管10ul能长几千个吧。要是不够的话，你就多连接几管，多作几个转化。
3.关于池保存，你可以将池洗下来的菌，添加适量培养基摇匀（我一般摇5-8h，转速高些）后取一些菌提质粒，也可以按你说的，待洗下来菌液的摇匀后，转接一些从新摇菌提质粒。
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
3楼2012-07-20 11:07:41
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普通回帖

tzaixmc

木虫 (正式写手)
高手帮帮我啊
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2楼2012-07-20 08:02:13
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-07-20 11:07:41
1.载体质粒你先切胶回收，之后CIAP，最后直接溶液回收就可以了。
2.关于连接体系，一般做10ul吧，黏性末端采用T4连接酶吧，我一般体现为：1ul 10Xbuffer，1ul 酶，0.5-1ul 载体，剩余的全加目的片段补足至10ul。10 ...

你平时做的时候有测磷酸化后的载体和切胶回收的片段的浓度吗？我看你的连接体系，好像是不是目的片段是不是会比载体多啊？这样是不是会可能有很多片段连不到载体上啊？如果载体比目的片段多的话，这样理论上目的片段都能连到载体上吧(假设连接效率理想化)？
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4楼2012-07-20 14:13:40
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
rainwander: 金币+3, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:37
tzaixmc: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-07-22 12:51:11
tzaixmc: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-07-25 08:27:48
引用回帖:
4楼: Originally posted by tzaixmc at 2012-07-20 14:13:40
你平时做的时候有测磷酸化后的载体和切胶回收的片段的浓度吗？我看你的连接体系，好像是不是目的片段是不是会比载体多啊？这样是不是会可能有很多片段连不到载体上啊？如果载体比目的片段多的话，这样理论上目的片 ...

载体和目的片段的浓度没准确测过，也就简单跑了下核酸电泳。一般来说，目的片段与载体的摩尔比例在10:1比较合适。你的意思是，目的片段比载体多，连接不完全吧？，假设这样说，10ng DNA就完全包含你的所有DNA多样性了，连接时加1000ng DNA，是比载体多了很多，但是你的每个目的多样性DNA就有100个参与连接，这样你的覆盖完整率就很高了。
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5楼2012-07-20 15:47:03
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:48
library的保存一般使用96孔板或者384孔板保存活菌..
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6楼2012-07-20 19:43:14
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-07-20 15:47:03
载体和目的片段的浓度没准确测过，也就简单跑了下核酸电泳。一般来说，目的片段与载体的摩尔比例在10:1比较合适。你的意思是，目的片段比载体多，连接不完全吧？，假设这样说，10ng DNA就完全包含你的所有DNA多样性 ...

关于池保存，我直接用LB从平板上洗下来后是不是还要加甘油或DMSO于-80度保存啊？甘油或DMSO的终浓度是多少啊？
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7楼2012-07-22 12:53:03
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by tzaixmc at 2012-07-22 12:53:03
关于池保存，我直接用LB从平板上洗下来后是不是还要加甘油或DMSO于-80度保存啊？甘油或DMSO的终浓度是多少啊？...

甘油终浓度在20%左右就可以了
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8楼2012-07-22 14:41:17
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-07-20 15:47:03
载体和目的片段的浓度没准确测过，也就简单跑了下核酸电泳。一般来说，目的片段与载体的摩尔比例在10:1比较合适。你的意思是，目的片段比载体多，连接不完全吧？，假设这样说，10ng DNA就完全包含你的所有DNA多样性 ...

我最近做了一次，连接体系：10ul takara solution 1,4ul载体，6ul片段。10ul连接液转化100ul感受态，最后转化的细菌涂布两个平板，每个平板长出了有好几千个菌。转化效率挺高的，但就是阳性克隆太少，在一个平板上发现载体自连很多，就是蓝斑多，是不是CIAP没处理好啊？有什么好的建议吗？
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9楼2012-07-25 08:33:00
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
我觉得单酶切的应该磷酸化处理下
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10楼2012-07-25 08:42:28
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