| 查看: 2487 | 回复: 23 | ||||
| 本帖产生 1 个 MicEPI ，点击这里进行查看 | ||||
tzaixmc木虫 (正式写手)
|
[求助]
细菌基因组文库构建的相关问题
|
|||
|
目前想要用质粒pUCM-T建一个2-6kb的细菌基因组的质粒文库。实验室没人做过，啥也不懂，望高手出来解答一下。谢谢！ 1. 质粒载体酶切后要先切胶回收，再用CIAP处理完后再用切胶回收吗？ 2. 2-6kb的回收片段和末端磷酸化的载体连接时加入量多少比较合适？有人说按DNA载体和外源片断以6:1的摩尔比，那要分别加多少够做一次转化？ 3. 如果我想建这个库要8000的克隆，那我如果一次转化只有500个怎么办？是多做累积到8000个还是一次多做几管连接转化累计到8000个克隆？ 4. 对构建出来的文库我想用池的方式保存。我想要提取里面的质粒转化打另外一株菌中做活性检测，那这个质粒提取我是直接提取一个池的质粒，还是从这个池里接种一点到新的培养基中，培养起来再做转化？ 望高手出来解答一下啊，非常感谢！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 微生物生态学 | functional genomics |
» 猜你喜欢
调剂
已经有6人回复
-
一志愿 江南大学 085602 化工专硕 338分求调剂
已经有12人回复
-
材料专硕(0856) 339分求调剂
已经有8人回复
-
377求调剂
已经有5人回复
-
0703调剂，一志愿天津大学319分
已经有6人回复
-
一志愿南昌大学，085600，344分求调剂
已经有5人回复
-
308求调剂
已经有8人回复
-
找调剂
已经有9人回复
-
一志愿郑州大学085600求调剂
已经有12人回复
-
316求调剂
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 细菌的基因组在-20℃能放多久？
已经有7人回复
- 细菌基因组DNA提取 交流
已经有18人回复
- 基因组文库-----genomic library
已经有11人回复
- 求助：基因组文库构建时一般用什么Marker？
已经有12人回复
- 【求助/交流】如何构建细菌的基因组表达文库
已经有19人回复
- 【求助/交流】【求助】细菌未知功能基因的克隆方法
已经有14人回复
jinpeng_6118
木虫 (正式写手)
- MicEPI: 2
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 5027
- 散金: 25
- 红花: 2
- 帖子: 856
- 在线: 147.9小时
- 虫号: 1019189
- 注册: 2010-05-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tzaixmc: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-07-20 14:13:50
rainwander: MicEPI+1, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:24
感谢参与，应助指数 +1
tzaixmc: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-07-20 14:13:50
rainwander: MicEPI+1, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:24
|
1.载体质粒你先切胶回收，之后CIAP，最后直接溶液回收就可以了。 2.关于连接体系，一般做10ul吧，黏性末端采用T4连接酶吧，我一般体现为：1ul 10Xbuffer，1ul 酶，0.5-1ul 载体，剩余的全加目的片段补足至10ul。10ul连接体系转化一管，你的转化效率有点低，我一般连接一管10ul能长几千个吧。要是不够的话，你就多连接几管，多作几个转化。 3.关于池保存，你可以将池洗下来的菌，添加适量培养基摇匀（我一般摇5-8h，转速高些）后取一些菌提质粒，也可以按你说的，待洗下来菌液的摇匀后，转接一些从新摇菌提质粒。  |
3楼2012-07-20 11:07:41
tzaixmc
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2991.1
- 红花: 2
- 帖子: 830
- 在线: 197.9小时
- 虫号: 977490
- 注册: 2010-03-21
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
2楼2012-07-20 08:02:13
tzaixmc
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2991.1
- 红花: 2
- 帖子: 830
- 在线: 197.9小时
- 虫号: 977490
- 注册: 2010-03-21
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
4楼2012-07-20 14:13:40
jinpeng_6118
木虫 (正式写手)
- MicEPI: 2
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 5027
- 散金: 25
- 红花: 2
- 帖子: 856
- 在线: 147.9小时
- 虫号: 1019189
- 注册: 2010-05-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
rainwander: 金币+3, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:37
tzaixmc: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-07-22 12:51:11
tzaixmc: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-07-25 08:27:48
rainwander: 金币+3, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:37
tzaixmc: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-07-22 12:51:11
tzaixmc: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-07-25 08:27:48
|
载体和目的片段的浓度没准确测过，也就简单跑了下核酸电泳。一般来说，目的片段与载体的摩尔比例在10:1比较合适。你的意思是，目的片段比载体多，连接不完全吧？，假设这样说，10ng DNA就完全包含你的所有DNA多样性了，连接时加1000ng DNA，是比载体多了很多，但是你的每个目的多样性DNA就有100个参与连接，这样你的覆盖完整率就很高了。 |
5楼2012-07-20 15:47:03
克隆大虾
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 133 (高中生)
- 金币: 6030.9
- 散金: 236
- 红花: 10
- 帖子: 2367
- 在线: 1337.5小时
- 虫号: 93868
- 注册: 2005-09-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
6楼2012-07-20 19:43:14
tzaixmc
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2991.1
- 红花: 2
- 帖子: 830
- 在线: 197.9小时
- 虫号: 977490
- 注册: 2010-03-21
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
7楼2012-07-22 12:53:03
jinpeng_6118
木虫 (正式写手)
- MicEPI: 2
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 5027
- 散金: 25
- 红花: 2
- 帖子: 856
- 在线: 147.9小时
- 虫号: 1019189
- 注册: 2010-05-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
8楼2012-07-22 14:41:17
tzaixmc
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2991.1
- 红花: 2
- 帖子: 830
- 在线: 197.9小时
- 虫号: 977490
- 注册: 2010-03-21
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
9楼2012-07-25 08:33:00
jinpeng_6118
木虫 (正式写手)
- MicEPI: 2
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 5027
- 散金: 25
- 红花: 2
- 帖子: 856
- 在线: 147.9小时
- 虫号: 1019189
- 注册: 2010-05-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
10楼2012-07-25 08:42:28
5