| 查看: 2440 | 回复: 23 | ||||
| 本帖产生 1 个 MicEPI ，点击这里进行查看 | ||||
tzaixmc木虫 (正式写手)
|
[求助]
细菌基因组文库构建的相关问题
|
|||
|
目前想要用质粒pUCM-T建一个2-6kb的细菌基因组的质粒文库。实验室没人做过，啥也不懂，望高手出来解答一下。谢谢！ 1. 质粒载体酶切后要先切胶回收，再用CIAP处理完后再用切胶回收吗？ 2. 2-6kb的回收片段和末端磷酸化的载体连接时加入量多少比较合适？有人说按DNA载体和外源片断以6:1的摩尔比，那要分别加多少够做一次转化？ 3. 如果我想建这个库要8000的克隆，那我如果一次转化只有500个怎么办？是多做累积到8000个还是一次多做几管连接转化累计到8000个克隆？ 4. 对构建出来的文库我想用池的方式保存。我想要提取里面的质粒转化打另外一株菌中做活性检测，那这个质粒提取我是直接提取一个池的质粒，还是从这个池里接种一点到新的培养基中，培养起来再做转化？ 望高手出来解答一下啊，非常感谢！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 微生物生态学 | functional genomics |
» 猜你喜欢
308求调剂
已经有4人回复
-
NSFC申报书里申请人简历中代表性论著还需要在申报书最后的附件里面再上传一遍吗
已经有14人回复
-
材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐
已经有6人回复
-
化学调剂0703
已经有7人回复
-
327求调剂
已经有11人回复
-
调剂
已经有8人回复
-
梁成伟老师课题组欢迎你的加入
已经有7人回复
-
伙伴们，祝我生日快乐吧
已经有24人回复
-
中科院材料273求调剂
已经有3人回复
-
材料工程专硕274一志愿211求调剂
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 细菌的基因组在-20℃能放多久？
已经有7人回复
- 细菌基因组DNA提取 交流
已经有18人回复
- 基因组文库-----genomic library
已经有11人回复
- 求助：基因组文库构建时一般用什么Marker？
已经有12人回复
- 【求助/交流】如何构建细菌的基因组表达文库
已经有19人回复
- 【求助/交流】【求助】细菌未知功能基因的克隆方法
已经有14人回复
jinpeng_6118
木虫 (正式写手)
- MicEPI: 2
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 5027
- 散金: 25
- 红花: 2
- 帖子: 856
- 在线: 147.9小时
- 虫号: 1019189
- 注册: 2010-05-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tzaixmc: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-07-20 14:13:50
rainwander: MicEPI+1, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:24
感谢参与，应助指数 +1
tzaixmc: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-07-20 14:13:50
rainwander: MicEPI+1, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:24
|
1.载体质粒你先切胶回收，之后CIAP，最后直接溶液回收就可以了。 2.关于连接体系，一般做10ul吧，黏性末端采用T4连接酶吧，我一般体现为：1ul 10Xbuffer，1ul 酶，0.5-1ul 载体，剩余的全加目的片段补足至10ul。10ul连接体系转化一管，你的转化效率有点低，我一般连接一管10ul能长几千个吧。要是不够的话，你就多连接几管，多作几个转化。 3.关于池保存，你可以将池洗下来的菌，添加适量培养基摇匀（我一般摇5-8h，转速高些）后取一些菌提质粒，也可以按你说的，待洗下来菌液的摇匀后，转接一些从新摇菌提质粒。  |
3楼2012-07-20 11:07:41
tzaixmc
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2991.1
- 红花: 2
- 帖子: 830
- 在线: 197.9小时
- 虫号: 977490
- 注册: 2010-03-21
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
2楼2012-07-20 08:02:13
tzaixmc
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2991.1
- 红花: 2
- 帖子: 830
- 在线: 197.9小时
- 虫号: 977490
- 注册: 2010-03-21
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
4楼2012-07-20 14:13:40
jinpeng_6118
木虫 (正式写手)
- MicEPI: 2
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 5027
- 散金: 25
- 红花: 2
- 帖子: 856
- 在线: 147.9小时
- 虫号: 1019189
- 注册: 2010-05-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
rainwander: 金币+3, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:37
tzaixmc: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-07-22 12:51:11
tzaixmc: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-07-25 08:27:48
rainwander: 金币+3, 鼓励交流 2012-07-20 20:54:37
tzaixmc: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-07-22 12:51:11
tzaixmc: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-07-25 08:27:48
|
载体和目的片段的浓度没准确测过，也就简单跑了下核酸电泳。一般来说，目的片段与载体的摩尔比例在10:1比较合适。你的意思是，目的片段比载体多，连接不完全吧？，假设这样说，10ng DNA就完全包含你的所有DNA多样性了，连接时加1000ng DNA，是比载体多了很多，但是你的每个目的多样性DNA就有100个参与连接，这样你的覆盖完整率就很高了。 |
5楼2012-07-20 15:47:03
克隆大虾
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 133 (高中生)
- 金币: 5997.9
- 散金: 236
- 红花: 10
- 帖子: 2367
- 在线: 1337.3小时
- 虫号: 93868
- 注册: 2005-09-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
6楼2012-07-20 19:43:14
tzaixmc
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2991.1
- 红花: 2
- 帖子: 830
- 在线: 197.9小时
- 虫号: 977490
- 注册: 2010-03-21
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
7楼2012-07-22 12:53:03
jinpeng_6118
木虫 (正式写手)
- MicEPI: 2
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 5027
- 散金: 25
- 红花: 2
- 帖子: 856
- 在线: 147.9小时
- 虫号: 1019189
- 注册: 2010-05-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
8楼2012-07-22 14:41:17
tzaixmc
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2991.1
- 红花: 2
- 帖子: 830
- 在线: 197.9小时
- 虫号: 977490
- 注册: 2010-03-21
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
9楼2012-07-25 08:33:00
jinpeng_6118
木虫 (正式写手)
- MicEPI: 2
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 5027
- 散金: 25
- 红花: 2
- 帖子: 856
- 在线: 147.9小时
- 虫号: 1019189
- 注册: 2010-05-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
10楼2012-07-25 08:42:28
