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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】【求助】细菌未知功能基因的克隆方法
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未曾走过的路

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】【求助】细菌未知功能基因的克隆方法

各位达人，请教问题如下：

化合物A在WT菌株中的代谢途径是A->B->C.
在化学诱变株Mut中B->C的相关gene被阻断，有可能是调节gene，也有可能是功能gene。

其中化合物ABC已知，但只有A能买得到。
A->B的gene已知，B->C的功能gene未知。
WT菌株基因组未测序~（貌似花钱比较多）

请问有什么好的方法，克隆B-C的功能gene呢？
方法原理是什么？实验难度如何？可行性有多高？经费需求多少？

小弟金币不多，倾情奉献~
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1楼 2010-12-13 11:20:48
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
参考文献给你，呵呵。有专门建库的试剂盒，不过比较昂贵，其实建那么小的一个库用不着这样的kit。自己找一个粘粒载体就OK了。

这个是我当初做宏基因组文库的时候参考过的一个nature protocol，建库的过程很详细，适合新手。

Construction of soil environmental DNA cosmid libraries and screening for clones that produce biologically active small molecules

全文链接：

http://ryu.jgi-psf.org/general/protocols/HMW_eDNA.pdf
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12楼2010-12-13 22:27:06
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普通回帖

zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
看天(金币+1):鼓励回答 2010-12-13 12:22:31
scelab(金币+3):谢谢交流~ 2010-12-13 12:23:35
未曾走过的路(金币+1):谢谢你 2010-12-13 20:35:57
看B->C是由什么酶催化的，然后到与你的菌株亲缘比较近的基因组测过序的菌株中查找这个酶的编码基因，然后再通过这个基因设定兼并因为在你的菌株中PCR扩增，可能会得到这个基因。
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2楼2010-12-13 11:48:59
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未曾走过的路

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2010-12-13 11:48:59:
看B->C是由什么酶催化的，然后到与你的菌株亲缘比较近的基因组测过序的菌株中查找这个酶的编码基因，然后再通过这个基因设定兼并因为在你的菌株中PCR扩增，可能会得到这个基因。

这个酶是加羟基的，但是已知的基因组肯定没有这个，用同种的已知基因组的菌无法代谢A和B。
这个基因可能是新的，未知的
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3楼2010-12-13 20:38:24
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流 2010-12-13 21:15:08
Subtractive hybridization, or Microarray
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4楼2010-12-13 20:53:28
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)
请教
引用回帖:
Originally posted by 香菱儿 at 2010-12-13 20:53:28:
Subtractive hybridization, or Microarray

这两种方法是否是基于已知的genome全序列，或者部分DNA序列作为探针呢？

Subtractive hybridization，对于染色体DNA，如果突变株仅仅是失活，没有表达而已，而不是DNA缺失，这种情况怎么理解呢？
Microarray，是否也需要已知的探针呢？如果对未知基因没有可用任何信息呢？
请教
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5楼2010-12-13 21:14:49
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-13 21:48:59
未曾走过的路(金币+3):谢谢你 2010-12-13 21:49:22
引用回帖:
Originally posted by 未曾走过的路 at 2010-12-13 11:20:48:
各位达人，请教问题如下：

化合物A在WT菌株中的代谢途径是A->B->C.
在化学诱变株Mut中B->C的相关gene被阻断，有可能是调节gene，也有可能是功能gene。

其中化合物ABC已知，但只有A能买得到。
A- ...

这个和底物的检测手段有很大关系，如果底物能通过简单的分光光度计方法来分析，那是在上面各位提到的简单的方法不行，可以用genome library的手段筛数千个克隆的粘粒库来实现。技术上不存在什么困难，可能花时间会多一点。

花钱的话估计1-2W左右。
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6楼2010-12-13 21:43:56
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)
未曾走过的路(金币+1):呵呵 2010-12-13 21:55:36
这个还真不太懂
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7楼2010-12-13 21:49:19
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未曾走过的路

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-13 21:43:56:



这个和底物的检测手段有很大关系，如果底物能通过简单的分光光度计方法来分析，那是在上面各位提到的简单的方法不行，可以用genome library的手段筛数千个克隆的粘粒库来实现。技术上不存在什么困难，可能花 ...

如果底物能通过简单的分光光度计方法来分析，那是在上面各位提到的简单的方法不行------这句怎么理解呢，我的底物ABC都可以用紫外检测到，那上面的方法行还是不行呢？
genome library，粘粒库，是做DNA的库吗？因为没有任何手段鉴定，如何选呢？
假如以B作为底物，构建文库，是这样的吗？
请教
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8楼2010-12-13 21:55:15
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
未曾走过的路(金币+5):高人 2010-12-13 22:06:09
引用回帖:
Originally posted by 未曾走过的路 at 2010-12-13 21:55:15:

如果底物能通过简单的分光光度计方法来分析，那是在上面各位提到的简单的方法不行------这句怎么理解呢，我的底物ABC都可以用紫外检测到，那上面的方法行还是不行呢？
genome library，粘粒库，是做DNA的库吗？ ...

打错了，我是说上面几位提到的方法比较简单，但是如果这些方法不奏效的话，采用genome library的方法也不失为一种有效可行的方法。

底物ABC的紫外检测时候的波长及显色反应不一样吧？如果一样就不行了。

是做DNA的库，提取基因组DNA，然后建库，挑克隆，用96孔板培养克隆，加底物B反应，显色。看哪个能有C的显色反应，然后可以亚克隆，或者20kb左右的片段直接测序。
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9楼2010-12-13 22:02:56
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未曾走过的路

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-13 22:02:56:



打错了，我是说上面几位提到的方法比较简单，但是如果这些方法不奏效的话，采用genome library的方法也不失为一种有效可行的方法。
...

UV检测的时候ABC的最大吸收波长和峰型都不一样，但是可惜没有颜色。不过加显色剂的使之发色还没试过，以后可以试试。BC仅仅是一个羟基的差别，可能会有相同的反应
建库的方法，理论上可行。只是可能没有那么大的载体，你说的20kb的库，用SauA1切可行吗？载体是什么？有那么大的克隆载体吗？
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10楼2010-12-13 22:10:45
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+10):谢谢您的回复~~~ 2010-12-14 21:25:05
引用回帖:
Originally posted by 未曾走过的路 at 2010-12-13 22:10:45:

UV检测的时候ABC的最大吸收波长和峰型都不一样，但是可惜没有颜色。不过加显色剂的使之发色还没试过，以后可以试试。BC仅仅是一个羟基的差别，可能会有相同的反应
建库的方法，理论上可行。只是可能没有那么 ...

波长和颜色之一不一样都是可行的，呵呵。载体不存在问题，有的质粒都可以容纳20kb的（最好用粘粒，这个容量稳定），强烈建议不要用Sau3AI，这个酶太强了。我当初摸索条件太辛苦了。

我的一点经验是，载体最好采用平末端的限制性内切酶酶切，然后将你的DNA片段用常用的BamHI、EcoRI等酶酶切，然后平末端化，连接。或者更简单点就是用机械的方法使得DNA片段破碎，然后回收20kb左右的，平端化，连接。实在不想这么干的话，DNA及质粒都可以粘性末端酶切，这时候要控制好DNA部分酶切的时间，如果切割过于完全的话，可能你的目的基因会切断，一般这样的做法意味着你可能需要筛选更多的克隆。

[ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-13 at 22:21 ]
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11楼2010-12-13 22:17:52
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未曾走过的路

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-13 22:27:06:
参考文献给你，呵呵。有专门建库的试剂盒，不过比较昂贵，其实建那么小的一个库用不着这样的kit。自己找一个粘粒载体就OK了。

这个是我当初做宏基因组文库的时候参考过的一个nature protocol，建库的过程很详细 ...

恩恩，我仔细研读一下啊，谢谢！
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13楼2010-12-13 22:28:31
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):谢谢交流 2010-12-14 21:25:16
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-12-13 21:14:49:
请教

这两种方法是否是基于已知的genome全序列，或者部分DNA序列作为探针呢？

Subtractive hybridization，对于染色体DNA，如果突变株仅仅是失活，没有表达而已，而不是DNA缺失，这种情况怎么理解呢？
Mic ...

1. Subtractive hybridization is a method to detect the differentially expressed gene(s) rather than the genomic DNA sequence insertion or deletion.  
I haven't carried out this technique, so I do not have much experience on it.

2. As to Microarray, if you don't have the microarray of the very species, I think you can try using those of the nearest relative species. Of cause, in this case, I think it is hard to do Microarray.

个人观点，欢迎拍砖，呵呵！

[ Last edited by 香菱儿 on 2010-12-14 at 12:54 ]
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14楼2010-12-14 12:45:21
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未曾走过的路

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 香菱儿 at 2010-12-14 12:45:21:

1. Subtractive hybridization is a method to detect the differentially expressed gene(s) rather than the genomic DNA sequence insertion or deletion.  
I haven't carried out this technique, so I d ...

谢谢你的回复，我也有点小小的疑惑。如果是表达之后的基因差别，应该是rna吧，rna也能用这种方法检测吗？
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15楼2010-12-14 12:55:11
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