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[交流]
【求助/交流】【求助】细菌未知功能基因的克隆方法
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各位达人，请教问题如下： 化合物A在WT菌株中的代谢途径是A->B->C. 在化学诱变株Mut中B->C的相关gene被阻断，有可能是调节gene，也有可能是功能gene。 其中化合物ABC已知，但只有A能买得到。 A->B的gene已知，B->C的功能gene未知。 WT菌株基因组未测序~（貌似花钱比较多） 请问有什么好的方法，克隆B-C的功能gene呢？ 方法原理是什么？实验难度如何？可行性有多高？经费需求多少？ 小弟金币不多，倾情奉献~  |
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参考文献给你，呵呵。有专门建库的试剂盒，不过比较昂贵，其实建那么小的一个库用不着这样的kit。自己找一个粘粒载体就OK了。 这个是我当初做宏基因组文库的时候参考过的一个nature protocol，建库的过程很详细，适合新手。 Construction of soil environmental DNA cosmid libraries and screening for clones that produce biologically active small molecules 全文链接： http://ryu.jgi-psf.org/general/protocols/HMW_eDNA.pdf |
12楼2010-12-13 22:27:06
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brightfuture01
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brightfuture01
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scelab(金币+10):谢谢您的回复~~~ 2010-12-14 21:25:05
scelab(金币+10):谢谢您的回复~~~ 2010-12-14 21:25:05
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波长和颜色之一不一样都是可行的，呵呵。载体不存在问题，有的质粒都可以容纳20kb的（最好用粘粒，这个容量稳定），强烈建议不要用Sau3AI，这个酶太强了。我当初摸索条件太辛苦了。 我的一点经验是，载体最好采用平末端的限制性内切酶酶切，然后将你的DNA片段用常用的BamHI、EcoRI等酶酶切，然后平末端化，连接。或者更简单点就是用机械的方法使得DNA片段破碎，然后回收20kb左右的，平端化，连接。实在不想这么干的话，DNA及质粒都可以粘性末端酶切，这时候要控制好DNA部分酶切的时间，如果切割过于完全的话，可能你的目的基因会切断，一般这样的做法意味着你可能需要筛选更多的克隆。 [ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-13 at 22:21 ] |
11楼2010-12-13 22:17:52
13楼2010-12-13 22:28:31
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scelab(金币+3):谢谢交流 2010-12-14 21:25:16
scelab(金币+3):谢谢交流 2010-12-14 21:25:16
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1. Subtractive hybridization is a method to detect the differentially expressed gene(s) rather than the genomic DNA sequence insertion or deletion. I haven't carried out this technique, so I do not have much experience on it. 2. As to Microarray, if you don't have the microarray of the very species, I think you can try using those of the nearest relative species. Of cause, in this case, I think it is hard to do Microarray. 个人观点，欢迎拍砖，呵呵！  [ Last edited by 香菱儿 on 2010-12-14 at 12:54 ] |
14楼2010-12-14 12:45:21
15楼2010-12-14 12:55:11
