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未曾走过的路

新虫 (初入文坛)

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虫号: 1009524

[交流] 【求助/交流】【求助】细菌未知功能基因的克隆方法

各位达人，请教问题如下：

化合物A在WT菌株中的代谢途径是A->B->C.
在化学诱变株Mut中B->C的相关gene被阻断，有可能是调节gene，也有可能是功能gene。

其中化合物ABC已知，但只有A能买得到。
A->B的gene已知，B->C的功能gene未知。
WT菌株基因组未测序~（貌似花钱比较多）

请问有什么好的方法，克隆B-C的功能gene呢？
方法原理是什么？实验难度如何？可行性有多高？经费需求多少？

小弟金币不多，倾情奉献~

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1楼 2010-12-13 11:20:48

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+10):谢谢您的回复~~~ 2010-12-14 21:25:05

引用回帖:

Originally posted by 未曾走过的路 at 2010-12-13 22:10:45:

UV检测的时候ABC的最大吸收波长和峰型都不一样，但是可惜没有颜色。不过加显色剂的使之发色还没试过，以后可以试试。BC仅仅是一个羟基的差别，可能会有相同的反应

建库的方法，理论上可行。只是可能没有那么 ...

波长和颜色之一不一样都是可行的，呵呵。载体不存在问题，有的质粒都可以容纳20kb的（最好用粘粒，这个容量稳定），强烈建议不要用Sau3AI，这个酶太强了。我当初摸索条件太辛苦了。

我的一点经验是，载体最好采用平末端的限制性内切酶酶切，然后将你的DNA片段用常用的BamHI、EcoRI等酶酶切，然后平末端化，连接。或者更简单点就是用机械的方法使得DNA片段破碎，然后回收20kb左右的，平端化，连接。实在不想这么干的话，DNA及质粒都可以粘性末端酶切，这时候要控制好DNA部分酶切的时间，如果切割过于完全的话，可能你的目的基因会切断，一般这样的做法意味着你可能需要筛选更多的克隆。

[ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-13 at 22:21 ]