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tzaixmc木虫 (正式写手)
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[求助]
细菌基因组文库构建的相关问题
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目前想要用质粒pUCM-T建一个2-6kb的细菌基因组的质粒文库。实验室没人做过，啥也不懂，望高手出来解答一下。谢谢！ 1. 质粒载体酶切后要先切胶回收，再用CIAP处理完后再用切胶回收吗？ 2. 2-6kb的回收片段和末端磷酸化的载体连接时加入量多少比较合适？有人说按DNA载体和外源片断以6:1的摩尔比，那要分别加多少够做一次转化？ 3. 如果我想建这个库要8000的克隆，那我如果一次转化只有500个怎么办？是多做累积到8000个还是一次多做几管连接转化累计到8000个克隆？ 4. 对构建出来的文库我想用池的方式保存。我想要提取里面的质粒转化打另外一株菌中做活性检测，那这个质粒提取我是直接提取一个池的质粒，还是从这个池里接种一点到新的培养基中，培养起来再做转化？ 望高手出来解答一下啊，非常感谢！ |
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 微生物生态学 | functional genomics |
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7楼2012-07-22 12:53:03
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1.载体质粒你先切胶回收，之后CIAP，最后直接溶液回收就可以了。 2.关于连接体系，一般做10ul吧，黏性末端采用T4连接酶吧，我一般体现为：1ul 10Xbuffer，1ul 酶，0.5-1ul 载体，剩余的全加目的片段补足至10ul。10ul连接体系转化一管，你的转化效率有点低，我一般连接一管10ul能长几千个吧。要是不够的话，你就多连接几管，多作几个转化。 3.关于池保存，你可以将池洗下来的菌，添加适量培养基摇匀（我一般摇5-8h，转速高些）后取一些菌提质粒，也可以按你说的，待洗下来菌液的摇匀后，转接一些从新摇菌提质粒。  |
3楼2012-07-20 11:07:41
tzaixmc
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4楼2012-07-20 14:13:40
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载体和目的片段的浓度没准确测过，也就简单跑了下核酸电泳。一般来说，目的片段与载体的摩尔比例在10:1比较合适。你的意思是，目的片段比载体多，连接不完全吧？，假设这样说，10ng DNA就完全包含你的所有DNA多样性了，连接时加1000ng DNA，是比载体多了很多，但是你的每个目的多样性DNA就有100个参与连接，这样你的覆盖完整率就很高了。 |
5楼2012-07-20 15:47:03
