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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 细菌基因组文库构建的相关问题
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tzaixmc

木虫 (正式写手)

[求助] 细菌基因组文库构建的相关问题

目前想要用质粒pUCM-T建一个2-6kb的细菌基因组的质粒文库。实验室没人做过，啥也不懂，望高手出来解答一下。谢谢！
1.  质粒载体酶切后要先切胶回收，再用CIAP处理完后再用切胶回收吗？
2.  2-6kb的回收片段和末端磷酸化的载体连接时加入量多少比较合适？有人说按DNA载体和外源片断以6:1的摩尔比，那要分别加多少够做一次转化？
3.  如果我想建这个库要8000的克隆，那我如果一次转化只有500个怎么办？是多做累积到8000个还是一次多做几管连接转化累计到8000个克隆？
4. 对构建出来的文库我想用池的方式保存。我想要提取里面的质粒转化打另外一株菌中做活性检测，那这个质粒提取我是直接提取一个池的质粒，还是从这个池里接种一点到新的培养基中，培养起来再做转化？
望高手出来解答一下啊，非常感谢！
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1楼 2012-07-19 17:18:49
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
高手帮帮我啊
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2楼2012-07-20 08:02:13
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
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3楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-07-20 11:07:41
1.载体质粒你先切胶回收，之后CIAP，最后直接溶液回收就可以了。
2.关于连接体系，一般做10ul吧，黏性末端采用T4连接酶吧，我一般体现为：1ul 10Xbuffer，1ul 酶，0.5-1ul 载体，剩余的全加目的片段补足至10ul。10 ...

你平时做的时候有测磷酸化后的载体和切胶回收的片段的浓度吗？我看你的连接体系，好像是不是目的片段是不是会比载体多啊？这样是不是会可能有很多片段连不到载体上啊？如果载体比目的片段多的话，这样理论上目的片段都能连到载体上吧(假设连接效率理想化)？
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4楼2012-07-20 14:13:40
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
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5楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-07-20 15:47:03
载体和目的片段的浓度没准确测过，也就简单跑了下核酸电泳。一般来说，目的片段与载体的摩尔比例在10:1比较合适。你的意思是，目的片段比载体多，连接不完全吧？，假设这样说，10ng DNA就完全包含你的所有DNA多样性 ...

关于池保存，我直接用LB从平板上洗下来后是不是还要加甘油或DMSO于-80度保存啊？甘油或DMSO的终浓度是多少啊？
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7楼2012-07-22 12:53:03
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
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5楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-07-20 15:47:03
载体和目的片段的浓度没准确测过，也就简单跑了下核酸电泳。一般来说，目的片段与载体的摩尔比例在10:1比较合适。你的意思是，目的片段比载体多，连接不完全吧？，假设这样说，10ng DNA就完全包含你的所有DNA多样性 ...

我最近做了一次，连接体系：10ul takara solution 1,4ul载体，6ul片段。10ul连接液转化100ul感受态，最后转化的细菌涂布两个平板，每个平板长出了有好几千个菌。转化效率挺高的，但就是阳性克隆太少，在一个平板上发现载体自连很多，就是蓝斑多，是不是CIAP没处理好啊？有什么好的建议吗？
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9楼2012-07-25 08:33:00
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-07-25 08:42:28
我觉得单酶切的应该磷酸化处理下

我是单酶切的啊，CIAP处理了，载体自连还是很多啊？是不是CIAP失效了啊？
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11楼2012-07-25 10:26:01
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
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12楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-07-25 14:23:30
不好说，我们CIAP处理后的载体自连率很低的

你们用的什么公司的CIAP啊？我用的takara的
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13楼2012-07-25 19:47:52
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
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15楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-11-14 09:49:21
请问你构建的革兰氏阳性菌的基因文库吗？我现在基因都提不出来，我采用的事异丙醇沉淀法，发现异丙醇沉淀后没有絮状沉淀。能把你们的提取方法给我吗？...

不是，是阴性的
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16楼2012-11-14 11:40:26
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-11-14 12:10:10
那你们是用试剂盒提的？还是自配溶液提的？...

都试过，都行
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18楼2012-11-14 22:50:17
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
普通无菌的96孔板就行吧，有一种96孔板离心机可以用，一般培养基加150到200微升左右
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20楼2012-12-20 20:37:25
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