24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 2211  |  回复: 6

一面之缘1988

新虫 (小有名气)

[求助] 目的基因表达载体的构建问题~请指教

本人新人一名,知识匮乏,想请教大家一点关于表达载体的问题~~
当目的基因序列测出来后,老师让我做个表达,看看目的基因的表达产物怎样,好像是先要把目的基因PCR一下,然后再酶切,再将表达载体也用相同的酶切一下,露出相同的粘性末端,再连到表达载体上,转入感受态细胞中,增殖表达,SDS-PAGE验证。我想问下这个PCR引物是怎么设计呀,有什么要求,而且怎么保证酶切不会切断目的基因呢,表达产物又该怎么检测?
谢谢各位了~~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

karlgu18

新虫 (小有名气)

兄弟,你确定你在这儿应助。我觉得这些东西你问问你老板,他应当知道你没做过,或者直接找你们学校的做过分子生物学的人。这个比较简单的。
2楼2012-12-06 10:42:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

午夜的月光

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励新虫交流! 2012-12-07 11:52:01
引物设计有几个原则,去查一下书,很好查。最重要的是退火温度和引物自身不要成二聚体(DNA MAN 等软件可以分析)。在目的基因上下游各选取25个左右的碱基,注意目的基因的正负链,利用DNA MAN分析即可。用软件分析目的基因的酶切位点,在引物两端加酶切位点的时候不要有目的基因内酶切位点。表达产物一是看蛋白胶条带,若是酶,可以进一步测酶活
3楼2012-12-06 17:07:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一面之缘1988

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by karlgu18 at 2012-12-06 10:42:52
兄弟,你确定你在这儿应助。我觉得这些东西你问问你老板,他应当知道你没做过,或者直接找你们学校的做过分子生物学的人。这个比较简单的。

呵呵  也是~~不过老板忙 主要是外面的业务~~师兄我已经麻烦到不好意思再麻烦的地步了 呵呵 不过我也觉得得再厚脸皮一下了~
4楼2012-12-07 09:41:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hs19880208

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

在设计PCR引物的时候你就应该加相应的酶切位点了。酶切位点加入后PCR得到的产物就带有酶切位点(一般双酶切位点)。酶切过夜后,酶切产物过一下胶回收的试剂盒,把酶切后的小的片段去除。每个酶切位点都有独立识别位点。构建好的质粒在DH5a里克隆,抽质粒,转化到BL21里,用IPTG诱导,跑SDS-PAGE胶,用考亮染色,再脱色就可以看到表达的蛋白了。
5楼2013-03-27 15:44:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

这个不算太难的,先看表达载体有哪些合适的酶切位点,比如NdeI,NcoI这样识别序列有ATG起始密码子的,再看看目的基因含不含有这些位点,含有就不好连接了,挑好位点,计算下读码框是否正确,保证核糖体结合位点后的第一个ATG与目的基因是间隔3的倍数个碱基。下游的位点更好选,如果有6xHis标签,想融合表达的话,就注意下要是同一读码框,同时利用载体的终止密码子,如果没有这样的需要,就利用目的基因本身的终止密码子好了。基本是这样,具体还是看看书吧。
为什么
6楼2013-07-09 23:07:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Jane_Eyre

新虫 (初入文坛)

首先,你要分析一下你的目的基因,看是否含有你要用的酶的酶切位点,一面被切断,确定没有酶切位点之后,再设计引物, 目的基因两端的引物要添加相应的酶切位点和酶所对应的保护碱基就可以
不忘初心
7楼2014-08-26 09:55:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 一面之缘1988 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 329求调剂 +17 miaodesi 2026-04-02 20/1000 2026-04-05 18:33 by 蓝云思雨
[考研] 材料与化工363求推荐 +7 zh096 2026-04-04 7/350 2026-04-05 09:11 by 陌秋26
[考研] 285求调剂 +11 哦呦呼o 2026-04-04 11/550 2026-04-05 08:15 by 544594351
[考研] 材料与化工306分找调剂 +12 沧海轻舟e 2026-04-03 13/650 2026-04-04 23:45 by lqwchd
[考研] 295求调剂 +4 A你好研究生 2026-04-04 5/250 2026-04-04 22:46 by yu221
[考研] 0703求调剂 +6 zizimo 2026-03-31 6/300 2026-04-04 14:16 by 无际的草原
[考研] 297求调剂 +11 ljy20040718! 2026-04-03 13/650 2026-04-04 09:23 by 来看流星雨10
[考研] 387求调剂 +4 爱吃片豆土 2026-04-03 5/250 2026-04-04 08:10 by 岸上的一条鱼
[考研] 317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂 +6 YinTai 2026-04-03 6/300 2026-04-03 22:30 by 无际的草原
[考研] 266求调剂 +3 08电气工程 2026-04-03 3/150 2026-04-03 14:05 by 1753564080
[考研] 085801 总分275 本科新能源 求调剂 +19 bradoner 2026-04-01 23/1150 2026-04-03 10:07 by linyelide
[考研] 085600 295分求调剂 +19 W55j 2026-03-30 23/1150 2026-04-03 09:53 by 千千运气
[考研] 309求调剂 +14 呆菇不是戴夫 2026-04-02 14/700 2026-04-03 09:42 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿北京科技大学材料学硕328分求调剂 +6 1段时间 2026-03-31 7/350 2026-04-02 13:57 by 3041
[考研] 08工科求调剂290分 +5 1314捧花 2026-04-02 8/400 2026-04-02 13:16 by 乔哒哒哒
[考研] 372求调剂 +3 jj涌77 2026-04-02 3/150 2026-04-02 09:57 by olim
[考研] 一志愿北交大材料工程,总分358 +4 cs0106 2026-04-01 4/200 2026-04-02 07:42 by 尚水阁主
[考研] 求调剂0703 +5 周嘉尧 2026-03-31 8/400 2026-04-01 20:32 by ltltkkk
[考研] 省双一流重点一本大学招收调剂 +4 wwwwffffff 2026-03-31 7/350 2026-04-01 15:23 by wwwwffffff
[考研] 合肥区域性重点一本招收调剂 +4 6266jl 2026-03-30 8/400 2026-03-31 18:43 by 6266jl
信息提示
请填处理意见