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一面之缘1988

新虫 (小有名气)

[求助] 目的基因表达载体的构建问题~请指教

本人新人一名,知识匮乏,想请教大家一点关于表达载体的问题~~
当目的基因序列测出来后,老师让我做个表达,看看目的基因的表达产物怎样,好像是先要把目的基因PCR一下,然后再酶切,再将表达载体也用相同的酶切一下,露出相同的粘性末端,再连到表达载体上,转入感受态细胞中,增殖表达,SDS-PAGE验证。我想问下这个PCR引物是怎么设计呀,有什么要求,而且怎么保证酶切不会切断目的基因呢,表达产物又该怎么检测?
谢谢各位了~~
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hs19880208

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

在设计PCR引物的时候你就应该加相应的酶切位点了。酶切位点加入后PCR得到的产物就带有酶切位点(一般双酶切位点)。酶切过夜后,酶切产物过一下胶回收的试剂盒,把酶切后的小的片段去除。每个酶切位点都有独立识别位点。构建好的质粒在DH5a里克隆,抽质粒,转化到BL21里,用IPTG诱导,跑SDS-PAGE胶,用考亮染色,再脱色就可以看到表达的蛋白了。
5楼2013-03-27 15:44:13
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