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一面之缘1988

新虫 (小有名气)

[求助] 目的基因表达载体的构建问题~请指教

本人新人一名,知识匮乏,想请教大家一点关于表达载体的问题~~
当目的基因序列测出来后,老师让我做个表达,看看目的基因的表达产物怎样,好像是先要把目的基因PCR一下,然后再酶切,再将表达载体也用相同的酶切一下,露出相同的粘性末端,再连到表达载体上,转入感受态细胞中,增殖表达,SDS-PAGE验证。我想问下这个PCR引物是怎么设计呀,有什么要求,而且怎么保证酶切不会切断目的基因呢,表达产物又该怎么检测?
谢谢各位了~~
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hs19880208

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

在设计PCR引物的时候你就应该加相应的酶切位点了。酶切位点加入后PCR得到的产物就带有酶切位点(一般双酶切位点)。酶切过夜后,酶切产物过一下胶回收的试剂盒,把酶切后的小的片段去除。每个酶切位点都有独立识别位点。构建好的质粒在DH5a里克隆,抽质粒,转化到BL21里,用IPTG诱导,跑SDS-PAGE胶,用考亮染色,再脱色就可以看到表达的蛋白了。
5楼2013-03-27 15:44:13
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karlgu18

新虫 (小有名气)

兄弟,你确定你在这儿应助。我觉得这些东西你问问你老板,他应当知道你没做过,或者直接找你们学校的做过分子生物学的人。这个比较简单的。
2楼2012-12-06 10:42:52
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午夜的月光

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励新虫交流! 2012-12-07 11:52:01
引物设计有几个原则,去查一下书,很好查。最重要的是退火温度和引物自身不要成二聚体(DNA MAN 等软件可以分析)。在目的基因上下游各选取25个左右的碱基,注意目的基因的正负链,利用DNA MAN分析即可。用软件分析目的基因的酶切位点,在引物两端加酶切位点的时候不要有目的基因内酶切位点。表达产物一是看蛋白胶条带,若是酶,可以进一步测酶活
3楼2012-12-06 17:07:35
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一面之缘1988

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by karlgu18 at 2012-12-06 10:42:52
兄弟,你确定你在这儿应助。我觉得这些东西你问问你老板,他应当知道你没做过,或者直接找你们学校的做过分子生物学的人。这个比较简单的。

呵呵  也是~~不过老板忙 主要是外面的业务~~师兄我已经麻烦到不好意思再麻烦的地步了 呵呵 不过我也觉得得再厚脸皮一下了~
4楼2012-12-07 09:41:53
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