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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 目的基因表达载体的构建问题~请指教
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一面之缘1988

新虫 (小有名气)

[求助] 目的基因表达载体的构建问题~请指教

本人新人一名，知识匮乏，想请教大家一点关于表达载体的问题~~
当目的基因序列测出来后，老师让我做个表达，看看目的基因的表达产物怎样，好像是先要把目的基因PCR一下，然后再酶切，再将表达载体也用相同的酶切一下，露出相同的粘性末端，再连到表达载体上，转入感受态细胞中，增殖表达，SDS-PAGE验证。我想问下这个PCR引物是怎么设计呀，有什么要求，而且怎么保证酶切不会切断目的基因呢，表达产物又该怎么检测？
谢谢各位了~~
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1楼 2012-12-06 10:14:13
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hs19880208

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

在设计PCR引物的时候你就应该加相应的酶切位点了。酶切位点加入后PCR得到的产物就带有酶切位点（一般双酶切位点）。酶切过夜后，酶切产物过一下胶回收的试剂盒，把酶切后的小的片段去除。每个酶切位点都有独立识别位点。构建好的质粒在DH5a里克隆，抽质粒，转化到BL21里，用IPTG诱导，跑SDS-PAGE胶，用考亮染色，再脱色就可以看到表达的蛋白了。
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5楼2013-03-27 15:44:13
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karlgu18

新虫 (小有名气)
兄弟，你确定你在这儿应助。我觉得这些东西你问问你老板，他应当知道你没做过，或者直接找你们学校的做过分子生物学的人。这个比较简单的。
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2楼2012-12-06 10:42:52
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午夜的月光

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励新虫交流！ 2012-12-07 11:52:01
引物设计有几个原则，去查一下书，很好查。最重要的是退火温度和引物自身不要成二聚体（DNA MAN 等软件可以分析）。在目的基因上下游各选取25个左右的碱基，注意目的基因的正负链，利用DNA MAN分析即可。用软件分析目的基因的酶切位点，在引物两端加酶切位点的时候不要有目的基因内酶切位点。表达产物一是看蛋白胶条带，若是酶，可以进一步测酶活
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3楼2012-12-06 17:07:35
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一面之缘1988

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by karlgu18 at 2012-12-06 10:42:52
兄弟，你确定你在这儿应助。我觉得这些东西你问问你老板，他应当知道你没做过，或者直接找你们学校的做过分子生物学的人。这个比较简单的。

呵呵  也是~~不过老板忙 主要是外面的业务~~师兄我已经麻烦到不好意思再麻烦的地步了 呵呵 不过我也觉得得再厚脸皮一下了~
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4楼2012-12-07 09:41:53
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