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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] 利用PET-28b构建重组载体时将目的基因插在lac I基因中的酶切位点可以么

在构建两个基因的共表达时,如果选择将一个基因插入PET-28b中的lac I中可以么,为什么?
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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574759350: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-07-16 21:35:01
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-17 00:36:14
第一破坏了lac I基因,lac I不表达则本底表达较高(多克隆位点内的蛋白),IPTG诱导调控效果差。

至于插入lac I基因的蛋白是能诱导表达的(不能调控),全部是本底表达。而且你的插入蛋白表达后两端带着很长的无用氨基酸序列,对你的目的蛋白没有影响么?

所以这种做法对两个蛋白的表达都有影响,看你是什么目的了
岂能尽如人意,但求无愧我心
2楼2013-07-16 14:30:45
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574759350

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-07-16 14:30:45
第一破坏了lac I基因,lac I不表达则本底表达较高(多克隆位点内的蛋白),IPTG诱导调控效果差。

至于插入lac I基因的蛋白是能诱导表达的(不能调控),全部是本底表达。而且你的插入蛋白表达后两端带着很长的无 ...

好的,明白了
3楼2013-07-16 21:35:16
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-07-17 00:36:07
574759350: 金币+3 2013-07-17 09:34:24
不行,其实pet28a的LacI是wtLacIpromoter,表达量挺低的。。(我估计也就T7promoter的几百分之一吧。。 而且你往那里面插 RBS怎么办?)  只是刚好能抑制控制T7RNAP的lacUV5和PT7-LacO1,就是这样T7RNAP经常要需要T7的lysozyme来降低活性。
4楼2013-07-16 23:38:15
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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574759350: 金币+3 2013-07-17 09:34:39
这么做显然是不行的,这么做达不到你诱导表达的目的,而且正如楼上几位说的,LacI启动子的活性很弱,即使可以表达,但表达量会非常低,建议不要这么做
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2013-07-17 00:37:46
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