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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 利用PET-28b构建重组载体时将目的基因插在lac I基因中的酶切位点可以么
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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] 利用PET-28b构建重组载体时将目的基因插在lac I基因中的酶切位点可以么

在构建两个基因的共表达时，如果选择将一个基因插入PET-28b中的lac I中可以么，为什么？
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1楼 2013-07-16 11:06:36
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-07-16 21:35:01
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-17 00:36:14
第一破坏了lac I基因，lac I不表达则本底表达较高（多克隆位点内的蛋白），IPTG诱导调控效果差。

至于插入lac I基因的蛋白是能诱导表达的（不能调控），全部是本底表达。而且你的插入蛋白表达后两端带着很长的无用氨基酸序列，对你的目的蛋白没有影响么？

所以这种做法对两个蛋白的表达都有影响，看你是什么目的了
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岂能尽如人意，但求无愧我心
2楼2013-07-16 14:30:45
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-07-16 14:30:45
第一破坏了lac I基因，lac I不表达则本底表达较高（多克隆位点内的蛋白），IPTG诱导调控效果差。

至于插入lac I基因的蛋白是能诱导表达的（不能调控），全部是本底表达。而且你的插入蛋白表达后两端带着很长的无 ...

好的，明白了
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3楼2013-07-16 21:35:16
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-17 00:36:07
574759350: 金币+3 2013-07-17 09:34:24
不行，其实pet28a的LacI是wtLacIpromoter，表达量挺低的。。（我估计也就T7promoter的几百分之一吧。。 而且你往那里面插 RBS怎么办？）  只是刚好能抑制控制T7RNAP的lacUV5和PT7-LacO1，就是这样T7RNAP经常要需要T7的lysozyme来降低活性。
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4楼2013-07-16 23:38:15
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+3 2013-07-17 09:34:39
这么做显然是不行的，这么做达不到你诱导表达的目的，而且正如楼上几位说的，LacI启动子的活性很弱，即使可以表达，但表达量会非常低，建议不要这么做
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2013-07-17 00:37:46
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